细交链孢菌酮酸单克隆抗体的制备及其icELISA方法的建立

摘要

细交链孢菌酮酸（Tenuazonic acid）是一种真菌毒素，是链格孢霉(genus Alternaria)产生的有毒代谢产物。大量研究表明，TEA具有多种毒性，主要通过污染谷物、蔬菜和水果，给人类健康带来潜在威胁。目前对于TEA的检测主要采用高效液相串联质谱的方法，这种方法准确、可靠，但是检测过程相对繁琐，操作难度较大。近年来，由于免疫检测法具有灵敏、快速的优点，有利于大量样品的筛查，从而满足实际样品的检测需求，已经成为食品安全研究领域的热点。本研究以TEA为对象，通过合理设计合成半抗原，从而制备了TEA单克隆抗体，并建立了TEA间接竞争酶联免疫检测方法。主要研究内容和结果如下：
　　（1）人工抗原的合成与鉴定。结合细交链孢菌酮酸的特点，在五元环上引入间隔臂合成半抗原，定制合成半抗原TEA-CMO，经质谱和核磁共振技术鉴定，合成成功。通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白KLH偶联，制备出人工抗原，经紫外吸收光谱鉴定，最大吸收峰蓝移，表明偶联成功。
　　（2）单克隆抗体的制备。用免疫原TEA-CMO-KLH免疫BALB/c小鼠，第五次免疫后，检测抗血清效价为1:64000，抑制率为94.7%。取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合、培养，阳性孔通过有限稀释进行亚克隆，最终获得6株分泌TEA特异性抗体的杂交瘤细胞株。选取其中较好的一株，命名为TEA-a，其分泌抗体效价为1:128000，抑制率为93.7%。向小鼠腹腔注射TEA-a杂交瘤细胞得到腹水，纯化后抗体浓度为6.3 mg/mL，进行后续实验。
　　（3）icELISA方法的建立。建立了TEA间接竞争酶联免疫检测方法，其中抗体浓度为98.42 ng/mL，包被浓度设置为250 ng/mL，反应缓冲液为pH=7.4、0.01 mol/L PBS，不添加吐温和甲醇，一抗反应时间为40 min，二抗反应时间为40 min。优化后的方法检出限为(IC10)为1.00 ng/mL，IC50=18.50 ng/mL，线性检测范围为3.56～96.24 ng/mL，与其余7种链格孢霉毒素结构类似物无交叉反应，方法特异性好。果汁、啤酒样品中的添加回收率在85.45%～119.65%之间，与HPLC方法检测结果相关性良好（R2=0.9132），表明可以用于实际样品的检测。

目录

主要英文缩略对照表

1 前言

1.1链格孢霉毒素简介

1.2 TEA简介

1.3污染现状

1.4检测方法的研究现状

1.5研究目的与意义

1.6主要内容及技术路线

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2实验方法

3 结果与分析

3.1 人工抗原及抗原合成与鉴定

3.2 TEA抗体的制备

3.3 TEA-icELISA方法的建立

3.4 方法评价

4.1 讨论

4.2 结论

4.3 创新点

4.4 展望

致谢

参考文献

附图