苦瓜素类化合物对亚洲玉米螟Ofh细胞和粉纹夜蛾Hi-5细胞的毒理研究

摘要

苦瓜素（momordicins）是一类结构相似的葫芦烷型四环三萜类化合物，是源自于苦瓜（Momordica charantia L.）茎叶提取物中的重要抗虫次生代谢物。苦瓜素I和苦瓜素II是苦瓜叶片提取物中含量较多的一类化合物，苦瓜苷B是从苦瓜茎叶提取物中分离得到的新化合物。本文旨在细胞及蛋白组学水平上明确苦瓜素类化合物的抗虫作用机理，为筛选新型作用机制的生物农药提供科学依据。本研究以离体亚洲玉米螟Ostrinina furnacalis幼虫血细胞（Ofh）和粉纹夜蛾Trichoplusia ni卵巢细胞（Hi-5）为对象，在细胞水平系统地研究了苦瓜素I和苦瓜苷B对Ofh细胞的毒力，并研究了苦瓜素I对Hi-5细胞蛋白表达的影响。
　　1.苦瓜素Ⅰ和II及苦瓜苷B对Ofh细胞毒理
　　用CCK-8法比较了苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ、苦瓜苷B和印楝素A对Ofh细胞的增殖抑制作用；用倒置相差显微镜和荧光倒置显微镜观察了苦瓜素Ⅰ及苦瓜苷B对Ofh细胞形态结构的影响，并用台盼蓝染色法和流式细胞术研究了其对Ofh细胞的致坏死作用。旨在确定苦瓜素Ⅰ和新化合物苦瓜苷B对Ofh细胞的毒力作用，并探讨其作用机理。研究结果表明，苦瓜素Ⅰ、苦瓜素Ⅱ和苦瓜苷B对Ofh细胞有明显的增殖抑制作用，36 h后的IC50值分别为7.566、24.340及8.514μg/mL，苦瓜素Ⅰ及苦瓜苷B对Ofh细胞的增殖抑制作用明显强于苦瓜素Ⅱ及对照药物印楝素A。苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B处理后的Ofh细胞表现为体积膨大、表面变得粗糙并有明显的空泡现象，严重破坏了Ofh细胞的形态结构。进一步的研究结果表明，8μg/mL的苦瓜素Ⅰ及苦瓜苷B处理Ofh细胞12~48 h，细胞死亡率均高于对照组，呈一定的时间依赖关系。而且苦瓜素Ⅰ对Ofh细胞的急性毒力高于苦瓜苷B。Ofh细胞经AO/EB染色后，用荧光显微观察发现，苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B处理组细胞膜破裂，细胞核受损严重，细胞呈不均匀桔黄色-橙红色荧光，呈典型的坏死特征。流式细胞仪检测结果表明，苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B对Ofh细胞具有明显的致坏死作用。8μg/mL苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B处理Ofh细胞36 h后，总坏死率分别为74.92%±2.02%和49.77%±1.69%。苦瓜素Ⅰ和新化合物苦瓜苷B对Ofh细胞均具有有效的增殖抑制和致坏死作用，这可能是苦瓜素类化合物抑制亚洲玉米螟生长发育和生殖力的主要机制之一。
　　2.苦瓜素I对Hi-5细胞蛋白表达的影响
　　以MTT法研究了苦瓜素I和苦瓜苷B对粉纹夜蛾卵巢细胞（Hi-5）的增值抑制作用。结果表明：苦瓜素Ⅰ和苦瓜苷B对Hi-5细胞均具有明显的增殖抑制作用，苦瓜素Ⅰ对粉纹夜蛾Hi-5细胞的增值抑制作用强于苦瓜苷B。苦瓜素I处理Hi-5细胞12 h和36 h后的IC50值分别为19.239μg/mL和12.000μg/mL。根据36 h苦瓜素Ⅰ对Hi-5细胞的增殖抑制IC50值，以12μg/mL的苦瓜素Ⅰ处理Hi-5细胞，应用双向电泳蛋白质组学技术进一步探讨了其作用机理。用12μg/mL的苦瓜素Ⅰ处理Hi-5细胞后的处理组总蛋白表达谱与对照组相比，处理组检测到的蛋白质点明显少于对照组。对照组检测到1563个蛋白质斑点，处理组检测到1070个斑点，比对照组减少了493个蛋白质点。其中，处理组和对照差异蛋白有17个，2个蛋白点消失，15个蛋白点下调，采用MALDI-TOF/TOF质谱技术成功鉴定了16个差异表达蛋白，分别是异柠檬酸脱氢酶（ Isocitrate dehydrogenase）、核糖核苷二磷酸还原酶小亚基（Ribonucleoside-diphosphate reductase small chain）、过氧化物酶（POX-A）、磷酸甘油酸变位酶（ Phosphoglyceromutase）、NADH-泛醌氧化还原酶（ NADH ubiquinone oxidoreductase30 kDa）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase-1）、微管解聚相关蛋白（Stathmin）、鸟苷酸还原酶（GMP reductase1-like）、肌动蛋白（Actin-4）、外位ATP酶（Ecto-ATPase）、α-微管蛋白（Alpha-tubulin）、谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase）、延伸因子基因（Elongation factor1 alpha）、Poly（A）结合蛋白（PolyA-binding protein）、反式激活因子（Transactivator）、Vasa蛋白。

目录

声明

1 前言

1.1苦瓜素抗虫性研究进展

1.2 亚洲玉米螟和粉纹夜蛾的发生与为害

1.3 蛋白质组双向电泳技术在昆虫毒理学研究中的应用

1.4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 供试药剂

2.2 供试细胞

2.3 供试试剂

2.4 主要仪器

2.5 溶液的配置

2.6 试验方法

2.7 数据分析方法

3 结果与分析

3.1 苦瓜素Ⅰ和Ⅱ及苦瓜苷B对Ofh细胞的增殖抑制及其机制研究

3.2 苦瓜素Ⅰ和Ⅱ与苦瓜苷B复配对Ofh细胞的增殖抑制及联合作用

3.3 苦瓜素I和苦瓜苷B对Hi-5细胞增殖的抑制作用

3.4 苦瓜素Ⅰ对粉纹夜蛾Hi-5细胞蛋白质表达的影响

4 结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

致谢

参考文献

附录 攻读硕士期间发表论文和获奖情况