抗菌药对鸡肠道菌群及携带oqxAB基因耐药质粒传播的影响

摘要

抗生素的不合理使用能够影响肠道菌群之间的动态平衡，导致定植抗性的减弱，增加肠道感染的风险；同时还对肠道内微生物产生选择性压力，不仅能够通过诱导菌株靶位突变产生耐药性，还可以促进携带抗生素耐药基因的质粒进行水平传播，导致耐药性的扩散和多重耐药微生物储存库的形成。此外在抗生素的选择性压力作用下，菌株可以将异质性耐药表型作为中间阶段从而转变为耐药菌。目前有关抗生素的使用对鸡肠道菌群及其定植抗性的影响研究较匮乏，抗生素治疗对携带oqxAB基因的流行性耐药质粒水平传播的相关研究尚属空白。此外，oqxAB基因阳性的耐药质粒是否能够介导沙门氏菌对替加环素的异质性耐药尚属未知。为此本文开展了以下研究，来填补这些方面的空白，以期为临床合理使用抗生素，减缓和控制耐药性的产生和扩散提供理论依据。
　　本实验以携带oqxAB基因阳性耐药质粒的鼠伤寒沙门氏菌14028/pHXY0908为研究对象，通过饮水的方式给予雏鸡推荐剂量的黏菌素、利高霉素、恩诺沙星和阿莫西林，并设置空白对照组，采用细菌培养的方式分析抗生素压力对鸡肠道菌群及其定植抗性的影响。结果显示，抗生素的使用会对肠道内源性菌群产生不同程度的影响，其中利高霉素、阿莫西林和恩诺沙星组肠道菌群紊乱程度较大；黏菌素的影响小，除了肠杆菌数量减少，其他菌群未见有显著性的变化。给药组中菌株14028/pHXY0908的定植水平显著的高于对照组，说明抗生素的使用导致的肠道菌群改变会减弱定植抗性，从而增加雏鸡肠道感染风险。
　　质粒编码的多重耐药基因的水平转移是重要的公共健康问题，为了进一步了解抗生素治疗对耐药流行性质粒传播扩散的影响，本文在鸡肠道鼠伤寒沙门氏菌14028/pHXY0908感染模型基础上，分析了恩诺沙星和氟苯尼考治疗对oqxAB基因阳性质粒pHXY0908传播扩散的影响。采用细菌培养的方式分离攻毒菌14028/pHXY0908以及可能获得质粒的肠杆菌。通过PCR、复制子分型、接合转移和质粒酶切等实验验证体内接合子，PFGE和 MLST对体内接合子进行分析。qPCR分析粪便 DNA中 oqxAB基因和肠道主要共生菌的相对量。发现在治疗组和对照组中内源性大肠杆菌可以通过水平传播获得oqxAB基因阳性质粒pHXY0908，暗示了oqxAB阳性质粒能够在肠道菌群中快速传播。在治疗组中，oqxAB阳性的大肠杆菌平均分离率或分离频率显著高于对照组，表明治疗会促进oqxAB阳性质粒的转移。PFGE分析显示，这些大肠杆菌属于不同的谱型，以C型分离率最高。MLST表明大肠杆菌ST533与oqxAB转移扩散密切相关。qPCR分析表明抗生素的治疗会提供选择性压力，使得oqxAB在肠道内维持较高的水平。
　　细菌异质性耐药性表型已经在多种抗生素中发现，使得治疗方案的确立变得复杂。为了进一步了解oqxAB阳性质粒的耐药性特征，本文通过MIC和群体分布法来分析菌株14028/pHXY0908对替加环素药物敏感性表型。添加PAβN、测定细胞内药物蓄积浓度以及检测外排泵及其调控基因的mRNA表达水平评价菌株的外排泵活性。DNA测序分析调控基因突变。以鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028和消除质粒的耐药分离株为对照菌。结果显示，14028、14028/pHXY0908、14028/Δp52的MIC分别为0.5、1、1μg/mL。群体分布法表明只有14028/pHXY0908呈现异质性耐药性。空白传代后部分菌株能够维持稳定的耐药表型，MIC升高4-8倍。在14028/pHXY0908菌群中这些敏感性降低的分离株出现的频率显著的高于14028和14028/Δp52。添加PAβN能够恢复分离株对替加环素的敏感性。通过HPLC检测结果显示，在敏感性降低的分离株菌体内所测得的替加环素蓄积浓度显著的降低，表明了外排活性是导致敏感性降低的原因。通过RT-PCR发现在14028/pHXY0908异质性耐药的分离株中acrB、oqxB和ramA过量表达。DNA测序发现RamR存在多种突变，导致ramA过量表达。结果表明oqxAB阳性质粒能够赋予鼠伤寒沙门氏菌对替加环素异质性耐药，并且这种异质性耐药表型可能与外排泵AcrAB-TolC和OqxAB的过量表达相关。
　　综上所述，抗生素压力会导致雏鸡肠道菌群紊乱，减弱其定植抗性，增加雏鸡肠道感染外源性病原菌的风险；此外抗生素压力还会促进oqxAB阳性质粒的传播扩散。研究结果还表明 oqxAB基因阳性质粒通过影响外排泵的表达水平赋予鼠伤寒沙门氏菌对替加环素异质性耐药。

目录

声明

英文缩略词表或符号表

第1章 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的及意义

1.3 技术路线

2.1 引言

2. 2 材料方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 抗生素治疗促进耐药质粒的水平传播

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 鼠伤寒沙门氏菌对替加环素异质性耐药性

4.1 引言

4.2 材料方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 全文结论

5.1 全文结论

5.2本研究创新点

致谢

参考文献

附录A：发表文章及参加的相关学术会议

附录B：攻读博士期间所获奖项