H7亚型禽流感DNA疫苗及其免疫佐剂的初步研究

摘要

禽流感是一类由A型流感病毒引起的禽类的疾病。它给养禽业造成了巨大的经济损失，与此同时威胁着人类的健康。2013年3月，上海发现首例感染H7N9亚型流感的病例。2017年1月，广东发现的H7N9亚型流感病毒既能感染人也能感染禽类，且对禽类呈现高致病性。到2017年5月17日，人感染H7N9亚型流感病毒共1508例，其中死亡人数为577例，而且造成大量的禽类死亡。近年来，禽流感DNA疫苗等新型疫苗的研究越来越受关注。DNA疫苗具有安全性高和对变种病毒应对快速等优点，但仍存在转染效率和免疫原性低等不足，而开发筛选合适的佐剂可能会改善这些不足。
　　为研制H7亚型禽流感DNA疫苗，首先通过RT-PCR扩增 H7亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/OY1/2013（H7N9）的HA基因，之后根据鸡密码子偏嗜性优化该基因，得到优化的HA基因opHA7。分别将H7亚型禽流感病毒的未优化和优化的HA基因克隆至真核表达载体pCK，构建了重组质粒pCKHA7和pCKopHA7。这些重组质粒经测序确认正确后，将其转染到293T细胞中，之后通过Western blot检测其表达量。结果显示重组质粒pCKopHA7和pCKHA7均能高效地表达目的蛋白HA，且优化型质粒表达水平明显高于未优化型质粒，表达的目的蛋白大小均约70kDa。
　　为研制鸡和鸭IFN-α、IL-2高效表达真核质粒，并将其作为DNA疫苗免疫佐剂，分别根据鸡和鸭密码子偏嗜性将NCBI（National Center for Biotechnology）序列数据库公布的鸡和鸭IFN-α、IL-2基因组序列进行优化，得到鸡和鸭IFN-α、IL-2优化基因（opChIFN-α、opChIL-2、opDuIFN-α、opDuIL-2）。通过PCR在优化的鸭IFN-α、IL-2基因3'端添加HIS标签序列，得到含有HIS标签的优化的鸭IFN-α、IL-2基因（opDuIFN-α+HIS、opDuIL-2+HIS）。之后分别将这些优化的基因（即opChIFN-α、opChIL-2、opDuIFN-α+HIS、opDuIL-2+HIS）克隆至真核表达载体pCK，构建了优化型重组质粒（pCKopChIFN-α、pCKopChIL-2、pCKopDuIFN-α+HIS、pCKopDuIL-2+HIS）。这些重组质粒经测序确认正确后，将其转染到293T细胞中，之后通过Western blot检测，结果显示这些优化型重组质粒均能高效地表达目的蛋白，且这些蛋白大小均在15-25kDa之间。
　　为评估免疫佐剂对DNA疫苗免疫效果的影响，试验将30只5周龄SPF鸡分为4组。其中对照组12只鸡注射pCK空载体，pCKopHA7免疫组6只鸡注射pCKopHA7 质粒，pCKopHA7和pCKopChIFN-α联合免疫组6只鸡注射pCKopHA7和pCKopChIFN-α质粒，pCKopHA7和pCKopChIL-2联合免疫组6只鸡注射pCKopHA7和pCKopChIL-2质粒。采取腿部多点注射方式进行免疫。首免第14天进行二免，二免第14天用滴鼻点眼的方式以100μL106EID50的A/chicken/Guangdong/Q1/2016（H7N9）病毒攻击所有试验鸡。结果显示：pCK空载体对照组免疫期间血清抗体平均值都为0log2，攻毒后7天内全部死亡；pCKopHA7免疫组血清抗体平均值由一免第14天的0.6log2上升至二免第14天的4.8log2，攻毒后无死亡，排毒率为50%，保护率为50%；pCKopHA7和pCKopChIFN-α联合免疫组血清抗体平均值由一免第14天的3.7log2上升至二免第14天的6.2log2，且高于pCKopHA7免疫组1.4log2，攻毒后无死亡，排毒率为33.33%，保护率为66.67%；pCKopHA7和pCKopChIL-2联合免疫组血清抗体平均水平由一免第14天的2.4log2上升至二免第14天的6.2log2，且高于pCKopHA7免疫组1.4log2，攻毒后无死亡，排毒率为33.33%，保护率为66.67%。
　　综上所述，H7亚型禽流感DNA疫苗pCKopHA7免疫SPF鸡后能诱导机体产生良好的抗体水平，并抵御H7N9亚型禽流感病毒的攻击。此外，pCKopChIFN-α质粒和pCKopChIL-2质粒均能促进机体产生更高的抗体水平，增强了H7亚型禽流感DNA疫苗的免疫效果。

目录

声明

英文缩略表

1 绪论

1. 1 禽流感病毒近年来的流行概况

1. 2 禽流感疫苗的研究

1. 3 提高DNA疫苗免疫效果的策略

1. 4 DNA疫苗的免疫佐剂

1. 5 本研究的目的及意义

2. 1 材料

2.1.1 禽流感病毒

2.1.2 ChIFN-α、ChIL-2、DuIFN-α、DuIL-2基因及质粒

2.1.3 载体与感受态细胞

2.1.4 实验动物

2.1.5 主要试剂盒

2.1.6 工具酶

2.1.7 主要试剂

2.1.8 主要仪器和设备

2.1.9 常用试剂的配制

2. 2 方法

2.2.1 基因的获取及优化

2.2.2 质粒的构建及抽提

2.2.3 重组质粒的体外表达检测

2.2.4 SPF鸡的免疫

2.2.5 HI抗体检测

2.2.6 攻毒试验

3 结果与分析

3.1 H7亚型AIV的HA基因的RT-PCR扩增结果

3. 2 基因密码子优化结果

3.2.1 H7亚型AIV的HA基因的密码子优化结果

3.2.2 ChIFN-α基因的密码子优化结果

3.2.3 ChIL-2基因的密码子优化结果

3.2.4 DuIFN-α基因的密码子优化结果

3.2.5 DuIL-2基因的密码子优化结果

3. 3 重组质粒的构建和鉴定

3.3.1 重组质粒pCKHA7和pCKopHA7的构建和鉴定

3.3.2 重组质粒pCKChIFN-α和pCKopChIFN-α的构建和鉴定

3.3.3 重组质粒pCKChIL-2和pCKopChIL-2的构建和鉴定

3.3.4 重组质粒pCKopDuIFN-α+HIS的构建和鉴定

3.3.5 重组质粒pCKopDuIL-2+HIS的构建和鉴定

3. 4 重组质粒体外表达结果

3.4.1HA7基因重组质粒Western blot检测结果分析

3.4.2鸡IFN-α和IL-2基因重组质粒Western blot检测结果分析

3.4.3鸭IFN-α和IL-2基因重组质粒Western blot检测结果分析

3. 5 抗体检测结果

3. 6 攻毒试验结果

4 讨论

全文总结

致谢

参考文献

附录