一种抗H7亚型和H5亚型禽流感病毒的疫苗组合物、及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种抗H7亚型和H5亚型禽流感病毒的疫苗组合物，该疫苗组合物包含有免疫量的H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原、免疫量的H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体，该H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原由H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白组装而成，该H7亚型禽流感病毒HA抗原蛋白如Seq ID No.1所示，该H7亚型禽流感病毒NA抗原蛋白如Seq ID No.2所示，该H7亚型禽流感病毒M1抗原蛋白如Seq ID No.3所示。本发明的疫苗组合物能针对现有的H7亚型流行株进行保护，较相同抗原含量的灭活疫苗效果相当或更优，且本发明疫苗组合物各组分之间产生了协同增效作用，进一步保障了免疫效果。

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种提供针对抗H7亚型和H5亚型禽流感病毒的疫苗组合物、及其制备方法和应用。

背景技术

病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)，是由病毒的结构蛋白组装而成的介于15nm～400nm的空心颗粒。VLPs的制备可以通过体外高效表达某种病毒的一种(或几种)结构蛋白，使其自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒。其方法主要是将病毒结构蛋白基因克隆到表达载体中，再将这些载体转入原核或真核细胞中进行表达。

禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科，流感病毒属，A型流感病毒。禽流感(Avian Influenza，AI)是由该病毒引起的禽类感染和疾病综合症。国际兽医局(OIE)和我国《家畜家禽防疫条例》均将该病列为A类烈性传染病。目前在世界上许多国家和地区都有该病发生的报道，其中尤为以H5亚型、H7亚型毒株引起的高致病性禽流感(HPAI)更为严重，其以突然发病和高死亡率为主要特征，常常导致饲养鸡群的全部死亡。

截止到目前，接种全病毒疫苗仍然是预防和控制禽流感病毒流行的最有效手段。然而，由于禽流感病毒的变异速度远远大于变异株相应疫苗的研发制备速度，而且不同亚型之间几乎不产生交叉免疫保护，因此禽流感疫苗的生产需要时时、不断更新，而针对流感病毒流行株相应疫苗的生产周期较长、生产成本较高，造成人力、物力的浪费，还有可能达不到理想的防控效果。而禽流感病毒样颗粒疫苗采用基因工程技术，研发周期短，特别是真核表达体系、原核表达体系和酵母表达体系的生产成本可控，能避免上述缺点。

但是，目前现有技术中文献研究发表的禽流感病毒样颗粒疫苗虽然能产生较好的免疫应答，但依然达不到商品化全病毒疫苗的免疫效果，且普遍表达效率较低，为此，筛选理想的禽流感毒株序列制备一种免疫效果良好、安全、成本可控的禽流感病毒样颗粒疫苗是当务之急，也符合国家提出的有效防控重大动物疫病，保障畜牧业健康可持续发展的需要。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种抗H7亚型和H5亚型禽流感病毒的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含有免疫量的H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原、免疫量的H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原和药学上可以接受的载体，所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原由H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白组装而成，所述H7亚型禽流感病毒HA抗原蛋白如SeqID No.1所示，所述H7亚型禽流感病毒NA抗原蛋白如Seq ID No.2所示，所述H7亚型禽流感病毒M1抗原蛋白如Seq ID No.3所示。

所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，能提供对H7亚型禽流感病毒的完全保护，其免疫效力与相同HA抗原含量的灭活苗相当或更优。

作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原由H5亚型2.3.4.4d分支病毒样颗粒抗原和H5亚型2.3.2.1d分支病毒样颗粒抗原组成；所述H5亚型2.3.4.4d分支病毒样颗粒抗原由其HA、NA、和牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白组装而成，所述H5亚型2.3.4.4d分支禽流感病毒HA抗原蛋白如Seq ID No.4所示，所述H5亚型2.3.4.4d分支禽流感病毒NA抗原蛋白如Seq ID NO.5所示，所述牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白如Seq ID No.8所示氨基酸序列；以及所述H5亚型2.3.2.1d分支病毒样颗粒抗原由其HA、NA、和牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白组装而成，所述H5亚型2.3.2.1d分支病毒HA抗原蛋白如Seq ID NO.6所示，所述H5亚型2.3.2.1d分支病毒NA抗原蛋白如Seq ID NO.7所示，所述牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白如Seq ID No.8所示氨基酸序列。

所述H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，能提供对H5亚型禽流感病毒的完全保护，其免疫效力与相同HA抗原含量的灭活苗相当或更优。

作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价≥6log2。

本发明的H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，当其含量为HA效价6log2时，也能产生完全保护，在免疫后14天即可产生针对禽流感的完全保护，其免疫效果较更高HA抗原效价的灭活苗免疫效果更优。

作为本发明的一种优选实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2。

本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗中H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量的HA效价可以任意选自6.0log2、6.1log2、6.2log2、6.3log2、6.4log2、6.5log2、6.6log2、6.7log2、6.8log2、6.9log2、7.0log2、7.1log2、7.2log2、7.3log2、7.4log2、7.5log2、7.6log2、7.7log2、7.8log2、7.9log2、8.0log2。作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2，所述H5亚型2.3.4.4d分支病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2，所述H5亚型2.3.2.1d分支病毒样颗粒抗原含量为HA效价6log2～8log2。

本发明的H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原具有良好的免疫原性，当其含量为HA效价6log2时，也能产生完全保护，在免疫后14天即可产生针对禽流感的完全保护，其免疫效果较更高HA抗原效价的灭活苗免疫效果更优。

本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗中H5亚型2.3.4.4d分支禽流感病毒样颗粒抗原含量的HA效价可以任意选自6.0log2、6.1log2、6.2log2、6.3log2、6.4log2、6.5log2、6.6log2、6.7log2、6.8log2、6.9log2、7.0log2、7.1log2、7.2log2、7.3log2、7.4log2、7.5log2、7.6log2、7.7log2、7.8log2、7.9log2、8.0log2。

本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗中H5亚型2.3.2.1d分支病毒样颗粒抗原含量的HA效价可以任意选自6.0log2、6.1log2、6.2log2、6.3log2、6.4log2、6.5log2、6.6log2、6.7log2、6.8log2、6.9log2、7.0log2、7.1log2、7.2log2、7.3log2、7.4log2、7.5log2、7.6log2、7.7log2、7.8log2、7.9log2、8.0log2。

本发明的疫苗组合物各组分之间在上述含量范围内产生了协同增效作用，进一步保障了免疫效果。

作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物中，所述药学上可以接受的载体为佐剂，所述佐剂选自：(1)矿物油、铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA206、Gel佐剂中的一种或几种；优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；优选地，所述佐剂为矿物油佐剂，其用于制备油包水乳剂；

所述佐剂含量为5％-70％V/V，优选从30％-70％V/V，更优选66％V/V。

作为本发明的一种实施方式，所述的药学上可接受的载体包括药物、免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

本发明还涉及一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将所述H7亚型禽流感病毒的HA、NA、M1抗原蛋白基因克隆到同一载体，将所述H5亚型禽流感病毒的HA、NA抗原蛋白基因、牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白基因克隆到另一同一载体；步骤(2)将所述步骤(1)获得的载体经转化重组获得含有所述H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒，将所述步骤(1)获得的载体经转化重组获得含有所述H5亚型禽流感病毒HA、NA抗原蛋白基因、牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒；步骤(3)将所述步骤(2)获得的所述含有H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9，串联表达所述H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白，将所述步骤(2)获得的所述含有所述H5亚型禽流感病毒HA、NA抗原蛋白基因、牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞sf9，串联表达所述所述H5亚型禽流感病毒HA、NA抗原蛋白、牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白；以及步骤(4)分离在所述昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中的由所述H7亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原蛋白组装而成的所述H7亚型禽流感病毒样颗粒抗原，分离在所述昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中的由所述H5亚型禽流感病毒HA、NA抗原蛋白、牛免疫缺陷病毒Gag抗原蛋白组装而成的所述H5亚型禽流感病毒样颗粒抗原；加入佐剂，混匀得到所述的疫苗组合物。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的制备所述的疫苗组合物的方法中，所述步骤(1)中所述载体均为pFastBac I；所述步骤(2)中所述的杆状病毒质粒为Bacmid。

本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗禽流感病毒导致的疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述的应用中，所述禽流感病毒为H7亚型和/或H5亚型禽流感病毒。

本发明所述的制备预防和/或治疗禽流感病毒感染的药物的施用对象包括鸡。

本发明的禽流感病毒样颗粒疫苗其抗原为H7亚型禽流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA、神经氨酸酶NA和基质蛋白M1的自我装配体或H5亚型禽流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA、神经氨酸酶NA、牛免疫缺陷病毒Gag的自我装配体。本发明利用昆虫杆状病毒表达系统生产禽流感病毒样颗粒抗原，具有产量高，生产成本低，免疫原性好，无生物安全风险等优点，不仅能对H7亚型禽流感提供保护活性，还能对H5亚型2.3.4.4d分支以及H5亚型2.3.2.1d分支禽流感提供保护活性。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

定义

“抗原(Antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

“病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)”是由一种或多种病毒结构蛋白组装成的颗粒，具有与病毒颗粒相似的外部结构和抗原性，但不含病毒基因。

本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有禽流感病毒样颗粒抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对禽流感的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除禽流感病毒抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括矿物油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Montanide ISA 206或Gel佐剂中的一种或几种。

“基因重组”：是指控制不同性状的基因重新组合。现代基因工程技术在试管内按人为的设计实施基因重组，也称为重组DNA，目的是将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不同性状的个体细胞内DNA分子上，使之发生遗传变异。来自供体的目的基因被转入受体细菌后，可进行基因产物的表达，从而获得用一般方法难以获得的产品。

“转化(transformation)”是指通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。

术语“预防和/或治疗”在涉及禽流感病毒感染时是指抑制禽流感病毒的复制、抑制禽流感病毒的传播或防止禽流感病毒在其宿主体内定居，以及减轻禽流感病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1H7亚型禽流感病毒样颗粒的表达

1、载体改造

以商品化载体pFastBac I为模板，在4413-4414位处依次插入XhoI、SphI、NheI、MluI、EcoRI和XbaI限制性酶切位点。PCR产物加入Dpn I酶1μl消化掉模板质粒，取5μl按照常规方法转化DH5α，改造成功的质粒命名为pFastBac mut。

2、三表达盒供体质粒的构建

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表Seq ID NO.1所示的HA基因、Seq IDNO.2所示的NA基因、Seq ID NO.3所示的M1基因，基因上游、下游分别加内切酶BamHI和HindIII酶切位点。分别将合成的HA基因、NA基因、M1基因通过BamHI和HindIII酶切，和同样酶切的pFastBac mut进行连接，连接产物转化DH5α，鉴定正确的质粒命名为pFastBac mut-HA、pFastBac mut-NA和pFastBac mut-M1。

以pFastBac mut-NA为模板，扩增NA表达盒，用SphI和MluI双酶切后连入pFB-M1质粒中，获得pFastBac mut-M1-NA质粒；再以pFastBac mut-HA为模板，扩增HA表达盒用XhoI和SphI双酶切后，连入pFastBac mut-M1-NA质粒中，获得pFastBac mut-M1-HA-NA三基因串联表达的供体质粒。

3、重组Bacmid构建及鉴定

将2μl pFastBac mut-M1-HA-NA质粒加入DH10Bac感受态细胞，轻弹混匀，冰上孵育30min，42℃热激45s，冰上孵育5min后加入400μl的SOC培养基37℃200rpm 4h，取100μl菌液涂布于含有IPTG/X-gal/卡那/四环/庆大三抗平板，37℃培养至少48h，待蓝白菌落明显时挑取白色单一菌落至5ml卡那/四环/庆大三抗液体LB培养基摇菌过夜。次日取1μl作为模板进行菌液PCR鉴定。PCR产物经鉴定正确，使用天根质粒小提试剂盒中试剂进行重组杆粒的提取，命名为rBacmid-MNH。

4、重组杆状病毒的获得及传代

将重组杆粒rBacmid-MNH转染昆虫细胞sf9。参照

将对数生长期的sf9细胞按照2.5×10

5、蛋白的表达及鉴定

将传至P4的重组病毒按照MOI为0.1～1接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心收获上清。经测定细胞外上清中HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态。

实施例2H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备

将实施例1收获的病毒样颗粒加入到矿物油佐剂中，制备各疫苗组合物，具体配比见表1。

表1 H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗组合物配比

实施例3H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的稳定性试验

将实施例2制备的疫苗1、和疫苗2分别置于2-8℃条件下保存12个月，保存12个月后的疫苗1和疫苗2分别命名为疫苗1-1和疫苗2-1。通过电镜观察，结果显示，保存12个月后，疫苗1-1和疫苗2-1依然稳定。

取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第1组、第2组分别经颈部皮下注射免疫实施例2制备的疫苗1和疫苗2，第3组、第4组分别经颈部皮下注射免疫保存12个月后的疫苗1-1、疫苗2-1，第5组经颈部皮下注射免疫商品化灭活苗(H5(Re-11+Re-12)、H7(H7-Re2)三价灭活苗，H7HA含量为8log2)，免疫剂量为0.3ml，第6组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后14日、21日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表2。

表2H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗稳定性试验结果

*备注：使用哈兽研H7(H7-Re2)标准抗原

结果显示，第1组、第2组、第3组、第4组、第5组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H7亚型感染的免疫保护；第3组、第4组免疫组14日HI抗体效价平均值与第1组、第2组免疫组14日HI抗体效价平均值相当；第5组免疫组14日HI抗体效价平均值低于第1组、第2组、第3组、第4组免疫组14日HI抗体效价平均值。表明本发明实施例2制备的H7亚型禽流感病毒样颗粒疫苗稳定性好，2-8℃条件下保存12个月依然稳定，HI抗体效价无影响；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。

实施例4H5亚型禽流感病毒样颗粒的表达

4.1、H5亚型2.3.4.4d分支病毒样颗粒的表达

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表Seq ID NO.4所示的HA基因、Seq IDNO.5所示的NA基因、Seq ID NO.8所示的Gag基因，参照实施例1的方法构建重组杆状病毒，命名为rBac-GNH-1。将传至P4的重组病毒按照MOI为0.1～1接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心收获上清。经测定细胞外上清中HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态。

4.2、H5亚型2.3.2.1d分支病毒样颗粒的表达

由苏州金唯智生物科技有限公司合成序列表Seq ID NO.6所示的HA基因、Seq IDNO.7所示的NA基因、Seq ID NO.8所示的Gag基因，参照实施例1的方法构建重组杆状病毒，命名为rBac-GNH-2。将传至P4的重组病毒按照MOI为0.1～1接种Sf9细胞，接种72-96h左右收获细胞，离心收获上清。经测定细胞外上清中HA含量为12log2。通过透射电镜观察，结果显示收获的蛋白呈现出病毒样颗粒形态，大小基本均匀，呈现为空心粒子状态。

实施例5H7、H5亚型二价禽流感病毒样颗粒疫苗的制备

将实施例1、实施例4收获的病毒样颗粒分别加入到矿物油佐剂中，制备各疫苗组合物，具体配比见表3。

表3H7、H5亚型二价禽流感病毒样颗粒疫苗组合物配比

实施例6H7、H5亚型二价禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第7组～第12组分别经颈部皮下注射免疫实施例5制备的疫苗3～疫苗8，第13组皮下注射商品化灭活苗(H5(Re-11+Re-12)、H7(H7-Re2)三价灭活苗，H7HA含量为8log2)，免疫剂量为0.3ml，第14组皮下注射0.3ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后14日、21日采血，分离血清，测定HI抗体效价*。免疫后不同HI抗体检测结果见表4、5、6。

表4H7、H5亚型二价禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果1

*备注：使用哈兽研H7(H7-Re2)标准抗原

结果显示，第11组、第12组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H7亚型感染的免疫保护，超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第13组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H7亚型感染的免疫保护；第11组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第7组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第12组免疫组和第13组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第12组免疫反应产生更快，14日即可达到第13组商品化疫苗21日的HI抗体平均值。表明本发明实施例5制备的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗7、疫苗8)均能提供理想的免疫效力；本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快。

表5H7、H5亚型二价禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果2

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-11)标准抗原

结果显示，第7组、第8组、第11组、第12组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护，超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第13组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.4.4d分支感染的免疫保护；第7组、第11组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第8组、第12组免疫组和第13组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第8组、第12组免疫反应产生更快，14日即可达到第13组商品化疫苗21日的HI抗体平均值；在相同HA剂量免疫下，第11组、第12组多组分免疫组HI抗体效价平均值高于第7组、第8组单组分免疫组。表明本发明实施例5制备的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗3、疫苗4)，还是多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗7、疫苗8)均能提供理想的免疫效力；且在多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗7、疫苗8)中各组分之间产生了协同增效作用，H5亚型2.3.4.4d分支病毒样颗粒抗原的免疫效果较单组分病毒样颗粒疫苗(疫苗3、疫苗4)更好，这是因为其他组分对H5亚型2.3.4.4d分支病毒样颗粒抗原产生了协同增效作用。且本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快；本发明提供的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗7、疫苗8)免疫效果更好。

表6H7、H5亚型二价禽流感病毒样颗粒疫苗免疫原性试验结果3

*备注：使用哈兽研H5(H5-Re-12)标准抗原

结果显示，第9组、第10组、第11组、第12组免疫组14日HI抗体效价平均值均高于6log2，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护，超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第13组商品化疫苗免疫组14日HI抗体效价平均值达到6log2以上，即可有效提供针对H5亚型2.3.2.1d分支感染的免疫保护；第9组、第11组在较灭活苗低的HA剂量免疫下，14日HI抗体效价平均值均依然可以超过第13组商品化疫苗免疫组同期免疫效果；第10组、第12组免疫组和第13组商品化疫苗组在相同剂量免疫时，第10组、第12组免疫反应产生更快，14日即可达到第13组商品化疫苗21日的HI抗体平均值；在相同HA剂量免疫下，第11组、第12组多组分免疫组HI抗体效价平均值高于第9组、第10组单组分免疫组。表明本发明实施例2制备的无论是单组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)，还是多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗7、疫苗8)均能提供理想的免疫效力，且在多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗7、疫苗8)中各组分之间产生了协同增效作用，H5亚型2.3.2.1d分支病毒样颗粒抗原的免疫效果较单组分病毒样颗粒疫苗(疫苗5、疫苗6)更好，这是因为其他组分对H5亚型2.3.2.1d分支病毒样颗粒抗原的免疫效果产生了协同增效作用。且本发明提供的病毒样颗粒疫苗组合物较商品化全病毒灭活疫苗免疫效果更好，免疫反应更快；本发明提供的多组分的病毒样颗粒疫苗(疫苗7、疫苗8)免疫效果更好。

表明，本发明提供的病毒样颗粒疫苗均具有较好的免疫效果，多组分的病毒样颗粒疫苗产生了协同作用，免疫效果更好。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种抗H7亚型和H5亚型禽流感病毒的疫苗组合物、及其制备方法和应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 560

<212> PRT

<213> H7亚型禽流感病毒（H7 subtype, Avian Influenza Virus）

<400> 1

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<212> PRT

<213> H7亚型禽流感病毒（H7 subtype, Avian Influenza Virus）

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<213> H5亚型禽流感病毒（H5 subtype, Avian Influenza Virus）

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<213> H5亚型禽流感病毒（H5 subtype, Avian Influenza Virus）

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355 360 365

Met Lys Gln Asp Ile Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly

370 375 380

Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro

385 390 395 400

Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Gln Pro Lys Glu Ser Thr Ile

405 410 415

Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr

420 425 430

Val Ser Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp

435 440 445

Lys

<210> 8

<211> 476

<212> PRT

<213> 牛免疫缺陷病毒(Bovine immunodeficiency virus)

<400> 8

Met Lys Arg Arg Glu Leu Glu Lys Lys Leu Arg Lys Val Arg Val Thr

1 5 10 15

Leu Gln Gln Asp Lys Tyr Tyr Thr Ile Gly Asn Leu Gln Trp Ala Ile

20 25 30

Arg Met Ile Asn Leu Met Gly Ile Lys Cys Val Cys Asp Glu Glu Cys

35 40 45

Ser Ala Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Thr Gln Phe Ser Ala Leu Asp

50 55 60

Leu Glu Asp Ser Pro Ile Lys Gly Lys Glu Glu Val Ala Ile Lys Asn

65 70 75 80

Thr Leu Lys Val Phe Trp Ser Leu Leu Ala Gly Tyr Lys Pro Glu Ser

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130 135 140

Thr Gln Ser Leu Pro Ala Ile Thr Thr Gln Asp Gly Thr Pro Arg Phe

145 150 155 160

Asp Pro Asp Leu Met Lys Gln Leu Lys Ile Trp Ser Asp Ala Thr Glu

165 170 175

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180 185 190

Ala Asn Leu Val Gln Glu Glu Ile Lys Leu Leu Leu Asn Ser Thr Pro

195 200 205

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210 215 220

Glu Asn Ala His Arg Thr Trp Lys Gln His His Pro Glu Ala Pro Lys

225 230 235 240

Thr Asp Glu Ile Ile Gly Lys Gly Leu Ser Ser Ala Glu Gln Ala Thr

245 250 255

Leu Ile Ser Val Glu Cys Arg Glu Thr Phe Arg Gln Trp Val Leu Gln

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275 280 285

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340 345 350

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355 360 365

Val Ala Ala Met Lys Glu Met Gly Ile Gln Ser Pro Ile Pro Ala Val

370 375 380

Leu Pro His Thr Pro Glu Ala Tyr Ala Ser Gln Thr Ser Gly Pro Glu

385 390 395 400

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405 410 415

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435 440 445

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Ser Val Thr Pro Ser Ala Pro Pro Leu Ile Leu Asp

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