解脂耶氏酵母脂肪酶2的热稳定性改造及其突变体表达水平的优化

摘要

本研究通过结合组合突变与分子模拟技术探究多对二硫键对解脂耶氏酵母脂肪酶2耐热性能的影响；并将脂肪酶突变体与分子伴侣PDI（Protein disulfide isomerase）、转录因子HAC1（The homologous to the activating transcript factor/cAMP-response e le me nt b ingd ing prote in）共表达于毕赤酵母，优化其表达水平。本研究旨在提高解脂耶氏酵母脂肪酶2在饲料工业的应用价值。本文分为四个试验：
　　试验一：将本实验室前期筛选出的强耐热型二硫键突变位点（S8-214、S60-69、S191-241、S122-196和S118-177）进行迭代组合，探究多对二硫键对该脂肪酶耐热性能的影响。试验二：利用Br id geD多模板算法扩大采样范围，筛选更多的二硫键潜在突变位点，将新筛选的突变位点加入突变位点库；再通过将相同或不同区域的二硫键组合，探讨区域组合效应；然后在试验一的基础上对该脂肪酶进行迭代组合突变。试验三：利用分子动力学模拟，从微观角度研究多对二硫键对该脂肪酶耐热性能的影响。试验四：将脂肪酶突变体与分子伴侣PDI和转录因子HAC1共表达，以优化表达水平。
　　试验结果如下：
　　1、将突变位点S191-241与S8-214或S122-196进行组合，脂肪酶突变体不能正常表达或酶催化效率大幅度降低。突变位点S8-214、S60-69、S122-196和S118-177间的组合均不影响各自的成键。通过迭代组合突变，获得引入两对、三对和四对二硫键的脂肪酶突变体（2S：S214+69、S214+196、S214+177、S69+196、S69+177和S196+177；3S：S214+69+196、S214+69+177、S69+196+177和S214+196+177；4S：4s）。其中脂肪酶突变体4s的耐热性能大幅度提高，其Td（Dnaturation temperature）和T1550（Half lost temperaturefor15 min）值分别为64.77和68.35℃，比野生型（Native）分别提高16.45和27.49℃。
　　2、利用BridgeD多模板算法，筛选出3个强二硫键脂肪酶耐热突变体S1-242、S2-210和S14-216。其Td值分别为63.69、58.80和54.02℃，比Native分别提高15.37、10.48和5.7℃；T1550值分别为61.35、54.19和50.00℃，比Native分别提高20.49、13.33和9.14℃。
　　3、在区域间组合较弱的二硫键，其突变体S214+69（t551/2=94.95 min）和S214+69+196（t601/2=72.96 min）的耐热性能，分别优于区域内组合较强二硫键的突变体S214+210（t551/2=44.43 min）和S214+210+216（t601/2=25.57 min）。
　　4、组合五对及六对二硫键的脂肪酶突变体（5s和6s）耐热性能极大幅度地提高。其Td值分别为68.55和70.85℃，分别比Native提高20.23和22.53℃；T1550值分别为70.69和72.09℃，分别比Native提高29.83和31.23℃。5s和6s的Topt（Optimum temperature）为55℃，pHopt（OptimumpH）值为4.5~5.0，组合突变拓宽了酶的反应温度和pH区间。
　　5、通过高温解折叠动力学模拟，脂肪酶突变体4s、5s和6s的RMSD（Root mean square deviation）、Rg（Radius of gyration）和二级结构稳定性均获得较大改善，但无法判断4s、5s和6s间的稳定性差异。通过将Rg与RMSD结合聚类分析，发现4s、5s和6s延迟了解折叠中间态的滞留时间，并能较好地判断其稳定性趋势。
　　6、将脂肪酶突变体5s、6s与分子伴侣重组载体pAO815-PDI共表达，结果表明PDI能显著改善5s、6s的表达水平（P<0.05），提高的幅度分别为60%和80%。将5s、6s与转录因子重组载体pAO815-HAC1、联合重组载体pAO815-PDI/HAC1共表达，结果表明HAC1对5s、6s表达水平无显著影响（P>0.05）。

目录

声明

常见缩写词

1 前言

1. 1 脂肪酶的结构和应用

1. 2解脂耶氏酵母脂肪酶2的结构和性质

1. 3 二硫键与热稳定性

1. 4分子伴侣与蛋白折叠

1. 5 研究目的与意义

2 试验材料

2. 1质粒和菌株

2. 2常用培养基与试剂

3. 1已存在的强二硫键突变位点的迭代组合

3. 2 新二硫键突变位点的筛选及其迭代组合

3. 3脂肪酶突变体的分子动力学模拟

3. 4脂肪酶突变体表达水平的优化

3. 5数据处理和分析

4结果与分析

4. 1 已存在的二硫键突变位点的迭代组合

4. 2 突变体的表达和纯化

4. 3 突变体的Td值和T1550值的测定

4. 4 BridgeD算法筛选结果

4. 5新筛选二硫键突变体及其迭代组合突变体的纯化及性质测定

4. 64s、5s和6s结构模型的构建

4. 7分子动力学模拟结果分析

4. 8优化载体的构建和重组工程菌株的电转化

4. 9重组工程菌株的生长情况和粗酶活测定

5讨论

5. 1新筛选的二硫键突变位点及其区域组合

5. 2 组合多对二硫键

5. 3 分子动力学模拟

5. 4 分子伴侣及转录因子与脂肪酶突变体的共表达

6结论

致谢

参考文献

附录突变PCR的模板和序列