两种球兰(Hoya)自然杂交的分子鉴定

摘要

自然杂交在植物物种形成和进化中发挥着重要的作用，同时也可以利用自然杂交产生的杂种选育植物优良新品种。球兰属（HoyaR.Br.）是萝藦科（Asclepiadaceae）牛奶菜族（Marsdens ieae），包括有200-300个种。球兰属植物在全国范围内球兰属植物自然分布有39种，其主要分布在广东、云南、广西等地区。本属植物具有很高的观赏价值。现阶段球兰属植物研究多集中在组织培养、药学价值和形态学研究。尽管球兰属有如此多物种，并且不少物种间地理分布重叠，但目前尚未见球兰属自然杂交的报道。
　　本研究通过分子方法对采集自四川的球兰sp1，一个疑似新种sp2及其疑似杂交种sp3进行鉴定。首先利用一个低拷贝核基因（Nic）和一个叶绿体基因间隔区（trnL-trnF），对样品进行测序并进行单倍型分析；然后采用ISSR分子标记技术分析这三个球兰属类群的遗传关系。主要结果如下：
　　（1）低拷贝核基因（Nic）和叶绿体基因间隔区（trnL-trnF）单倍型分析结果显示：三个球兰属类群在Nic基因上的变异位点数（S）为11，构成6个单倍型。sp1单倍型最多，拥有除H5外的5个单倍型；sp2具有两个单倍型，H1和H3；而sp3具有4个单倍型，H1，H3，H4和H5。因此单倍型H1与H3均为三个球兰属类群共享，H4为sp1与sp3共享。单倍型H5为sp3独有，单倍型H2和H6为sp1独有。尽管存在单倍型共享，不同类群之间的单倍型频率存在很大差异。叶绿体基因间隔区（trnL-trnF）数据显示：三个球兰属类群在该区域只有一个6bp的插入/缺失多态性，产生了两个单倍型，并且这三个类群具有两种单倍型，并且单倍型频率在三个类群中比较接近。
　　（2）10条ISSR引物从这三个球兰属类群中共扩增得到49条带，多态性条带为14条，多态性条带百分比为28.6％。通过POPGENE计算，得到遗传分化指数（gst）值为0.1175。通过NTSYS2.10e对样品进行遗传相似系数分析，三个球兰属类群共60个个体之间的遗传相似系数最小值为0。在遗传聚类分析构建出的聚类树状图中可以看出，当GS（Genetic Similarity）为0.34时，样品明显可分为两组，其中一类主要为sp1，也包括少量sp3个体，但不包括sp2的个体。数据表明sp1与sp2能够明显区分为两类别，结果与形态学差异几乎一致。
　　我们的结果表明sp3确实是由sp1和sp2之间的杂交而来，提供了二者发生杂交的分子证据。并且，无论核基因还是叶绿体基因，这两个物种间存在频繁的杂种介导的渐渗发生。这一点从ISSR分子标记的结果也可以看出，在由sp2组成的第二大支中，有一些sp1的个体聚在其中，显然发生了由sp2向sp1的渐渗。

目录

声明

缩略词表

1前言

1 .1 球兰属植物研究概况

1.1.1 球兰属植物分布及分类

1.1.2 球兰属植物应用

1 .2 植物自然杂交研究进展

1 .3 DNA分子标记技术

1.3.1RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）

1.3.2RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）

1.3.3AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）

1.3.4SSR（Simple Sequence Repeat）

1.3.5ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）

1.3.6cpDNA（chloroplast DNA）

1.3.7低拷贝核基因标记（Low copy nuclear gene）

1 .4本研究的目的与意义

2 材料与方法

2 .1实验材料

2 .2实验试剂

2 .3实验仪器

2 .4实验方法

2.4.1球兰属叶片DNA的提取

2.4.2筛选核基因以及叶绿体基因

2.4.3PCR产物的回收纯化、检测与测序

2.4.4目的核基因片段的扩增与检测

2.4.5 直接测序和克隆测序

2.4.6ISSR标记分析

3结果与分析

3 .1 低拷贝核基因Nic单倍型网络图分析

3 .2 叶绿体基因间隔区trnL-trnF片段分析

3.3 ISSR分析

3.3.1 多态性分析

3.3.2 相似系数分析

3.3.3 遗传聚类分析

4 讨论与结论

4 .1 sp1和sp2的遗传分化

4 .2sp1和sp2自然杂交的分子证据

4 .3结论

致谢

参考文献

附录1