五没食子酰葡萄糖(PGG)降解产物的分离鉴定及生物活性研究

摘要

1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose,PGG）分布于中草药植物和果蔬中，大量的实验数据表明PGG具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗病毒、抗过敏及抗炎等多种生物活性，是近年来的研究热点。本论文通过单宁酶水解PGG，获取PGG的降解产物。采用高效制备液相色谱法从PGG酶解液中分离制备其降解产物，经质谱和核磁共振分析其结构。初步评价其抗氧化活性、抗肿瘤活性和抗炎活性，为深入研究PGG及其降解产物生物活性和作用机理提供基础。主要研究结果如下：
　　(1)采用分光光度计法测得该单宁酶活力为200 U/g，经HPLC检测其纯度达95%以上。利用最大酶活为参照，确定该单宁酶有效作用的最佳pH值为4.5~6.0，最佳作用温度为45~50℃。在酶添加量为单宁质量的0.10%~0.20%且酶解时间在40~60 min时，单宁酶降解PGG的效果与人体肠道菌群的降解类似。
　　(2)利用高效制备液相色谱法从PGG酶解液中分离制备其降解产物，得到5个灰白色粉末状的产物分别命名为P1、P2、P3、P4、P5。经HPLC检测，P1纯度约为76.5%、P2纯度约为79.2%、P3纯度约为71.5%、P4纯度约为92.3%和P5纯度约为98.0%。
　　(3)通过HPLC-MS分析PGG降解产物的化学结构。结果表明：PGG降解产物的分子量依次为787、635、483、169，且存在多种同分异构体。通过与文献数据对照，确定化合物的可能结构，P1和P2分子量同为787，判断为TGG（四没食子酰基葡萄糖）的同分异构体，P3为TriGG（三没食子酰基葡萄糖），P4为DGG（二没食子酰基葡萄糖），P5符合没食子酸的分子量大小，经与标准品对比，确定P5为GA（没食子酸）。
　　(4) PGG及其降解产物的抗氧化活性比较。采用清除DPPH、ABTS自由基及O RAC法评价其抗氧化能力。结果显示：清除DPPH自由基法中，清除率达50%时的浓度分别为：TriGG（49.8μg/mL）、PGG（46.2μg/mL）、DGG（42.5μg/mL）、TGG（36.0μg/mL）和GA（29.6μg/mL），GA、TGG和DGG自由基清除能力均强于PGG。在清除ABTS自由基中，所有降解产物IC50均小于PGG，说明降解产物的清除能力均强于PGG。ORAC法显示，自由基清除能力GA＞PGG，而TGG、TriGG、DGG均与PGG活性相当。研究发现，PGG的各降解产物均有较强的抗氧化能力，降解产物的抗氧化能力甚至比PGG本身更强。
　　(5) PGG及其降解产物的抗肿瘤活性研究。选用HCT-116细胞作为研究对象，用不同浓度的PGG处理HCT-116细胞，采用MTT法测定细胞存活率。利用SPSS20.0软件，计算出PGG的IC50值为29.6μg/mL，PGG对HCT-116细胞的增殖具有剂量-效应关系；以PGG的IC50浓度29.6μg/mL作为工作浓度，作用24 h，各降解产物抑制率分别为：GA（42.4%）、DGG（30.5%）、TriGG（39.8%）、TGG（34.5%），对比发现PGG的抗肿瘤活性是最强的， GA相对于其他降解产物抗肿瘤活性较强。PGG及其降解产物均具有较强的抗肿瘤活性。
　　(6) PGG及其降解产物的抗炎活性评价。通过MTT实验，选择不影响细胞增殖活性的10~30μg/mL浓度进行实验。中性红法表明，PGG对吞噬作用的促进效果低于其降解产物。以LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7构建细胞炎症模型，地塞米松作为阳性对照组，研究降解产物对IL-1β、TN F-α、IL-6和N O等四个炎症因子分泌的影响。结果显示：PGG及其降解产物均显著抑制RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α和NO，抑制效果与样品浓度存在一定的剂量效应；PGG能明显抑制了IL-6的分泌，但降解产物对IL-6抑制效果相对偏弱。综上所述，PGG及降解产物均具有较强的抗炎活性，其抗炎效果要优于地塞米松。

目录

论文所用缩写及中英文对照表

1前言

1.1 PGG概况

1.2 PGG生物活性的研究进展

1.3 PGG吸收降解的研究进展

1. 4肠道菌群对多酚类化合物降解

1. 5 单宁酶降解多酚类化合物的应用

1. 6研究目的和意义

1. 7研究内容

2. 1 实验材料

2. 2 实验试剂

2. 3 主要仪器与设备

2. 4 技术路线

2. 5实验方法

3 结果与分析

3. 1单宁酶水解PG G实验

3. 2 降解产物的体外抗氧化活性评价

3. 3 降解产物的体外抗肿瘤活性

3.4 降解产物对巨噬细胞RAW264.7的影响

4 讨论与结论

4.1 PGG及其降解产物抗氧化活性研究

4. 2单宁酶水解PG G的降解途径

4.3 PGG降解产物的抗氧化活性对其发挥抗氧化活性的影响

4. 4总结

4. 5创新点

4. 6展望

致谢

参考文献