采后龙眼果肉自溶中Caspase酶及相关基因的作用研究

摘要

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）又名桂圆、益智，具有较高的营养和保健价值，尤其果肉性温、味甘，有“南方小人参”之美誉，深受消费者喜爱。但龙眼果实成熟于高温高湿的盛夏，采后生理代谢旺盛，果实容易变色变质，难以保鲜。常温下，龙眼果肉在采后3-4d即出现快速软化、溶解流汁和腐烂的现象，称为“果肉自溶”，严重制约采后贮藏寿命。前人研究表明龙眼采后果肉自溶可能是一种细胞程序性死亡（PCD），Caspase-3为PCD关健酶。
　　本试验研究了常温（25℃）下六种包装方案对‘石硖’龙眼果实的贮藏效果。分析了四个品种龙眼采后果肉自溶的特性及其过程中Caspase-3和Caspase-4的活性变化，并研究其与自溶指数的相关性。克隆Metacaspase（DlMCⅡ-1和DlMC-1）基因序列，并对其进行亚细胞定位分析、在果肉自溶、不同组织及盐胁迫诱导龙眼叶片衰老过程中的表达模式分析，以探究Metacaspase在常温贮藏条件下果肉自溶中的作用。
　　主要研究结果如下：
　　1．在常温（25℃）贮藏条件下，六种包装袋对‘石硖’龙眼采后果实贮藏期的影响存在明显差异，但综合果皮色度值、果皮褐变指数、果肉自溶指数和质量损失率的结果来看，ZSMA（中山气调袋）处理效果最好，其次为 BOPP（双向拉伸聚丙烯膜），再次为PE（聚乙烯膜）和“小托盘+双层0.01mmPE”，“小托盘+单层0.01 mmP E”效果最差；EVA（乙烯-醋酸乙烯共聚物）处理较为特殊，果皮褐变最严重，但果肉质量保持得最好。
　　2.采用 BOPP袋包装的四个品种龙眼果实在常温贮藏条件下，果皮色度 a*值、果肉含水量和褐变指数均随贮藏时间的延长而升高，果肉含水量与自溶指数相关性不明显，除‘储良’外，其余三个品种褐变指数与自溶指数均呈显著正相关；色度 L*值、b*值、C*值和果肉TSS含量均随时间的延长而降低，其中L*值与自溶指数呈显著负相关，‘石硖’和‘东壁’的a*值、b*值、C*值和TSS含量与自溶指数无明显相关性，‘储良’和‘水眼’的L*值、b*值和TSS含量与自溶指数均呈显著负相关，但前者的a*值、C*值和后者的a*值均与自溶指数相关性不明显。
　　3．2015年四个品种龙眼果实挂树期果肉 Caspase-3活性随采收时间逐渐升高；果肉自溶过程中Caspase-3和Caspase-4活性随贮藏时间延长均上升，与自溶指数均呈极显著正相关；2016年四个品种龙眼果肉自溶过程中Caspase-3和Caspase-4活性随贮藏时间延长均升高，其中Caspase-4活性与自溶指数呈显著正相关，‘石硖’和‘东壁’中 Caspase-3活性与自溶指数均呈显著正相关，但在‘储良’和‘水眼’中不明显。
　　4．通过对2015年和2016年四个品种贮藏期间的褐变指数与自溶指数进行因子分析后发现，在常温贮藏条件下，‘储良’的自溶水平最低，褐变水平居中；‘石硖’和‘水眼’褐变水平均较低，自溶水平居中；‘东壁’褐变和自溶水平均较高，为最不耐贮藏品种。
　　5.采用RT-PCR技术从龙眼果实中成功克隆到两条PCD相关基因Metacaspase的CDS序列，分别命名为DlMCⅡ-1和 DlMC-1。氨基酸序列分析表明，其翻译的蛋白均为酸性不稳定蛋白，其中DlMCⅡ-1基因推测的氨基酸序列与荔枝（ AM B51354.1）同源性为94%，DlMC-1基因推测的氨基酸序列与甜橙（KDO57066.1）同源性为83%；系统进化树分析结果表明DlMCⅡ-1基因与荔枝（ AM B51354.1）处于同一分枝小组，进化距离最近；DlMC-1与甜橙CsMC-1进化距离最近。由此可推测DlMCⅡ-1可能与荔枝LcMCⅡ-1有类似功能，DlMC-1可能与甜橙CsMC-1有类似功能。
　　6．农杆菌介导转化烟草叶片和烟草原生质体的亚细胞定位结果均表明，DlMCⅡ-1蛋白定位在细胞质中，与荔枝LcMCⅡ-1定位结果一致，也与动物中Caspases定位在细胞质中的结果相吻合。
　　7．实时荧光定量（qRT-PCR）分析DlMCⅡ-1和DlMC-1在四个不同品种和不同组织中的表达模式发现，DlMCⅡ-1和 DlMC-1在自溶指数较高的‘东壁’中表达量均显著高于自溶指数较低的‘石硖’，在‘水眼’和‘储良’中表达量均较低；两个基因在叶片中表达量均最高、其次为果肉，而在根、幼果和果皮中表达量最低；两个基因在盐胁迫诱导叶片衰老的过程中均显著上调表达。

目录

声明

本文缩略词及中英文对照

1 前言

1. 1 研究背景

1. 2 国内外研究现状和发展趋势

1. 3 龙眼采后果肉自溶研究进展

1. 4 研究目的及意义

2. 1试验材料

2. 2 试验处理和取样方法

2. 3 主要仪器设备

2. 4 试验方法

2. 5数据统计与分析

3 结果与分析

3. 1不同包装对‘石硖’龙眼果实采后常温贮藏效果的影响

3. 2四个品种龙眼果实常温贮藏期间品质变化比较

3.3四个品种龙眼果实挂树成熟期和采后贮藏果肉自溶过程中Caspase酶活性的变化（ 2015年）

3.4四个品种龙眼常温贮藏期间果肉Caspase酶活力的变化及在果肉自溶中的作用（2016年）

3.5龙眼果肉中Metacaspase酶的DlMC基因全长cDNA序列分析

3.6龙眼采后果肉自溶相关基因DlMCⅡ-1编码蛋白的亚细胞定位

3.7DlMC基因在四个品种龙眼果肉自溶过程中的表达量变化情况

3.8DlMC基因在龙眼不同组织中的表达情况

3.9 DlMC基因在盐处理叶片中的表达情况

3. 10四个品种龙眼贮藏期间自溶指数与各指标相关性分析（ 2016年）

4 讨论

4. 1包装处理对龙眼果实常温贮藏效果的影响

4.2龙眼果肉Metacaspase的亚细胞定位

4. 3Metacaspase酶在贮藏龙眼果肉自溶及盐胁迫处理中的作用

4.4 Caspase酶活变化及基因表达在龙眼贮藏期间果肉自溶中的作用

全文结论

致谢

参考文献

附录1

附录2

附录3 在读期间发表论文及获得的奖励