抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体基因的构建、筛选及其在大肠杆菌中的初步表达

摘要

木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain)是番木瓜乳汁中的一种半胱氨酸蛋白酶,具有凝乳和蛋白水解能力.由于番木瓜乳汁中的几种半胱氨酸蛋白酶具有相似的结构、性质和底物特异性,木瓜凝乳蛋白酶的特异性检测和高纯度分离纯化都存在一定的困难.为了更好地进行木瓜凝乳蛋白酶的检测和分离纯化,该课题进行了该酶基因工程单链抗体的制备研究.用木瓜凝乳蛋白酶免疫BALB/c小鼠,待血清达到理想效价后,取其脾脏提取到完整的RNA,RT-PCR法扩增出高产量的、大小分别为366bp和324bp的V<,H>和V<,L>基因片段.纯化回收的V<,H>和V<,L>在接近等摩尔浓度下,用重叠延伸拼接法以连接肽相连组装成单链抗体基因,获得大小为735bp的目的片段.scFv经SfiⅠ和NotⅠ双酶切,与经同样双酶切的噬粒载体pFAB5c连接,电转化法转化大肠杆菌XL1-blue,转化率为6.90×10<'6>/μgDNA,转化克隆经M13K07辅助噬菌体援救后,得到滴度为1.6×10<'5>cfu/mL,库容为1.46×10<'6>的中等大小的噬菌体抗体库.在此基础上,以木瓜凝乳蛋白酶为靶抗原对原是的噬菌体抗体库进行了4轮

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第一章绪论

1.1木瓜凝乳蛋白酶

1.2抗体研究概述

1.2.1抗原与抗体

1.2.2抗体的形成

1.3抗体产生技术的发展

1.3.1免疫动物

1.3.2杂交瘤技术

1.3.3基因工程抗体

1.4基因工程抗体的类型

1.4.1鼠/人嵌合抗体

1.4.2改型抗体

1.4.3小分子抗体

1.4.4双特异性抗体和双功能抗体

1.5噬菌体抗体库技术

1.6单链抗体的表达

1.7单链抗体的应用

1.7.1用于疾病的诊断

1.7.2用于基因治疗

1.7.3用于病毒性传染病的被动免疫

1.7.4用于构建双功能抗体或者是双特异性抗体

1.8本课题的意义和主要内容

1.8.1本课题的意义

1.8.2本课题的主要内容

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验动物与菌株

2.1.2主要仪器与设备

2.1.3主要试剂

2.1.4常用培养基、缓冲液及储备液

2.2实验方法

2.2.1抗木瓜凝乳蛋白酶scFv噬菌体抗体库的构建

2.2.2特异性抗木瓜凝乳蛋白酶scFv阳性克隆的筛选及鉴定

2.2.3可溶性抗体的表达

2.2.4可溶性抗体的分析和鉴定

2.2.5阳性克隆基因的序列分析

第三章结果与讨论

3.1抗木瓜凝乳蛋白酶scFv噬菌体抗体库的构建

3.1.1动物的免疫与脾脏总RNA的提取

3.1.2 RT—PCR

3.1.3 scFv基因的克隆化及噬菌体抗体库的构建

3.1.4重组噬粒的鉴定

3.2噬菌体抗体库的富集

3.3特异性抗木瓜凝乳蛋白酶scFv阳性克隆的筛选

3.4可溶性scFv的表达

3.4.1 gene3的切除

3.4.2阳性克隆表达产物的SDS—PAGE分析

3.4.3阳性克隆表达产物的双抗体夹心ELISA鉴定

3.5阳性克隆基因的序列分析

3.6讨论

3.6.1动物的免疫

3.6.2 RNA的抽提

3.6.3连接肽的选择

3.6.4噬菌体抗体库的多样性和库容量的问题

3.6.5筛选中可能出现的问题

3.6.6单链抗体的高效表达

结论与展望

参考文献

与学位论文相关的学术论文发表情况

致谢