细胞因子对乙肝DNA疫苗免疫作用的研究

摘要

基因疫苗的出现为乙型肝炎的防治带来了新的曙光,近年来的研究表明,HBV DNA疫苗能诱发机体产生特异性体液免疫、辅助T细胞(TH)增值、细胞毒性T细胞(CTL)激活,由于其在诱导免疫应答的许多方面比目前的常规HBV疫苗更具潜力,且具有清除乙肝病毒的功能,前景非常广阔.但是DNA疫苗诱导的免疫应答效力低,特别是应用于大型灵长目动物时抗原递呈效率低,从而妨碍了其实际运用,有必要对免疫方法进行改进.因此该论文利用基因重组技术,构建融合白细胞介素2和小鼠γ干扰素基因的重组质粒以及单独编码这两种蛋白的DNA质粒.结果表明,克隆的两种外源基因就是白介素-2和γ干扰素.用重组质粒转染COS7细胞,检测分析编码外源蛋白的表达,结果发现重组子都表达并分泌了所编码的外源蛋白.将构建的三个重组质粒作为免疫佐剂与pc-HBs DNA疫苗组合,免疫BLAB/c小鼠,两周后采眼底静脉血,检测使用佐剂对小鼠体液免疫应答效果的影响.结果表明,细胞因子基因佐剂的使用使乙肝DNA疫苗的体液免疫效果有显著提高(P<0.05),其中使用构建的融合质粒组与使用双佐剂组对诱导小鼠特异性抗体产生的增进效果最好(P<0.01),而单独使用干扰素则似乎对抗体产生有一定抑制作用.

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第一章绪论

1.1基因疫苗和基因免疫的概述

1.2基因疫苗的研究历史及应用现状

1.2.1流感DNA疫苗

1.2.2艾滋病DNA疫苗

1.2.3狂犬病DNA疫苗

1.2.4单纯疱疹病毒DNA疫苗

1.2.5结核病DNA疫苗

1.2.6疟疾DNA疫苗

1.2.7乙型肝炎DNA疫苗

1.3基因疫苗的作用机制

1.4基因疫苗的载体

1.5基因疫苗的免疫方式与途径

1.5.1免疫方法

1.5.2免疫途径

1.6 DNA疫苗的安全性和优越性

1.6.1 DNA疫苗的安全性

1.6.2 DNA疫苗的优越性

1.7增强DNA疫苗免疫应答策略的研究进展

1.7.1初次免疫和加强免疫的有效匹配

1.7.2.采用减毒活疫苗作为DNA疫苗的载体

1.7.3.使用具有协同作用的细胞因子DNA疫苗

1.7.4.具有免疫调节作用的CpG寡核苷酸

1.7.5以趋化因子与共刺激因子基因为DNA疫苗的免疫调节剂

1.8乙型肝炎表面抗原(HBsAG)DNA疫苗的研究现状

1.8.1乙型肝炎病毒基因组

1.8.2乙型肝炎表面抗原的(HBsAg)DNA疫苗研究现状

1.9本课题的研究意义和主要内容

1.9.1本课题的研究意义

1.9.2本课题的主要内容

第二章实验材料

2.1主要仪器设备

2.2实验器材

2.3常用试剂

2.4培养基

2.5酶类

2.6分子量参照物

2.7试剂与母液配置

第三章实验方法

3.1 PC-DNA简介

3.2.1目的片断酶切和回收

3.2.2 DNA片断连接

3.2.3转化

3.2.4转化子的鉴定及重组质粒的限制性内切酶分析

3.3.1目的片断酶切和回收

3.3.2 DNA片断连接

3.3.3转化

3.3.4转化子的鉴定及重组质粒的限制性内切酶分析

3.4融合质粒PC-IIFN的构建

3.4.1引物设计：

3.4.2 PCR扩增反应

3.5重组质粒的构建流程图

3.5.2PC-IFNγ的构建流程图

3.5.3融合质粒的构建流程图

3.6重组质粒转染COS7细胞及产物测定

3.6.1.参照FuGENE6 Transfect i on Reagent转染方法进行

3.6.2.用ELISA方法，检测IL-2的表达

3.6.3用ELISA方法，检测I FN-γ的表达

3.7免疫小鼠并分析效果

3.7.1.基因免疫接种

3.7.2.血清抗体检测：

3.8本实验常用方法汇总

第四章结果与讨论

4.1.聚合酶链式反应(PCR)扩增

4.1.3融合基因hIL2-mIFNγ PCR扩增凝胶电泳图

4.2.重组质粒的构建结果

4.2.2重组质粒pc-IFNγ的构建结果

4.2.3重组质粒pc-hIL2mIFNγ的构建结果

4.3重组质粒PC-HIL2MIFN γ的序列测定与结果分析

4.4重组质粒体外转染表达检测

4.4.1重组质粒表达白介素2的检测结果

4.4.2重组质粒表达γ干扰素的检测结果

4.5基因免疫小鼠的免疫效果分析

第五章结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

在读期间发表的论文：

致谢

附录