原生质体融合提高玫瑰茄细胞生长速率的研究

摘要

首先,对微甘菊愈伤组织诱导和继代增殖培养进行系统研究,愈伤组织诱导研究表明:外植体中芽尖诱导率最高,在含2,4-D2.0mg/L、KT1.0mg/L、pH5.8的MS培养基上25℃黑暗条件下愈伤组织诱导效果较好.继代培养的关键问题在于褐变控制,继代培养的优化条件为:培养基添加5.0 mg/L的抗坏血酸(Vc),激素比例改用2,4-D0.5mg/L+NAA2.0mg/L+KT0.5mg/L+BA0.5mg/L,添加15﹪新鲜椰子汁,于20001x光照16h/d培养,在细胞生长对数期进行继代转接.并对微甘菊细胞悬浮培养条件进行研究.然后,该文系统研究了微甘菊和玫瑰茄原生质体制备与再生的条件.结果表明,较好的原生质体分离方案为:取微甘菊和玫瑰茄新鲜愈伤组织或悬浮培养对数期细胞系作为材-;采用降糖、添加L-半胱氨酸和质壁分离三者结合的方式进行对两种植物细胞材料进行预处理;采用混和酶解液(组合为2﹪Celluase+0.5﹪Hemicellulase+0.2﹪Pectinase+CPW盐溶液+0.65mol/L甘露醇+0.1﹪2-N-吗啡啉乙磺酸+10mmol/L CaCl<,2>,pH5.7)26℃低速振荡酶解,微甘菊最适酶解时间为4h,玫瑰茄最适酶解时间为3h.低熔点琼脂糖包埋法比较适合培养原生质体;原生质体最适培养密度为5×10<'5>个/mL;采用KM8p培养基有利于原生质体的持续分裂和生长;最佳激素组合为:IAA 1.0mg/L+2,4-D 0.05mg/L+KT0.1mg/L;26℃培养温度和黑暗条件有利于原生质体再生成愈伤组织.继而,将微甘菊与玫瑰茄进行不对称融合.融合前将供体微甘菊原生质体进行UV辐射处理,研究UV对原生质体分裂及生长的钝化作用,结果表明辐射强度300 μ W/cm<'2>时处理时间6min为宜;将受体玫瑰茄原生质体用16mmol/LIOA预处理10min钝化.试验了融合过程各因素对融合效果的影响.最后,对所得杂种细胞生长与花青素合成的性状表达进行初步分析.原生质体融合后再生愈伤组织的形态特征初步表明得到了杂种细胞;通过酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶电泳谱带验证了融合获得了杂种细胞.经数次筛选的杂种细胞在优化条件下悬浮培养,花青素含量最高达到2.02﹪(g/gdw),产量可达0.372g/L.将杂种细胞悬浮培养情况和玫瑰茄细胞做了对比.

目录

文摘

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第一章绪论

1.1植物次级代谢细胞工程的概况

1.1.1植物细胞工程的兴起是历史发展的必然

1.1.2植物细胞培养技术的优越性

1.1.3植物细胞培养技术的历史回顾

1.2植物细胞培养技术生产花青素的研究概况

1.2.1花青素的研究概况

1.2.2植物细胞培养生产花青素的研究概况

1.3利用玫瑰茄细胞培养生产花青素的研究进展

1.3.1玫瑰茄的植物学特性

1.3.2关于玫瑰茄花青素提取及应用方面的研究

1.3.3利用玫瑰茄细胞技术培养生产花青素的研究进展

1.4植物原生质体融合研究进展

1.4.1植物原生质体融合技术的应用现状

1.4.2植物原生质体融合的操作技术

1.4.3原生质体融合技术发展趋势

1.5微甘菊研究进展

1.5.1分类特征

1.5.2生长特性及传播途径

1.5.3危害情况

1.5.4微甘菊清除方法

1.5.5微甘菊的研究动态

1.6本课题的研究目的和主要研究内容

1.6.1研究目的

1.6.2主要研究内容

参考文献

第二章微甘菊愈伤组织诱导与继代培养

2.1引言

2.2材料与仪器

2.2.1材料

2.2.2实验仪器

2.2.3主要试剂

2.3实验方法

2.3.1植物细胞

2.3.2主要培养基

2.3.3微甘菊愈伤组织的诱导

2.3.4微甘菊细胞的继代培养与培养基优化

2.4结果与讨论

2.4.1关于微甘菊愈伤组织诱导的研究

2.4.2关于微甘菊愈伤组织继代培养的研究

2.5本章小结

参考文献

第三章微甘菊细胞悬浮培养

3.1引言

3.2材料与仪器

3.2.1材料

3.2.2实验仪器

3.3实验方法

3.3.1微甘菊细胞悬浮培养体系的建立

3.3.2细胞生物量的测定

3.3.3培养基组分测定

3.4结果与讨论

3.4.1碳源对微甘菊细胞生长与营养消耗的影响

3.4.2氮源组合对微甘菊细胞生长的影响

3.4.3接种量对悬浮培养微甘菊细胞生长的影响

3.4.4微甘菊细胞悬浮培养的生长曲线

3.5本章小结

参考文献

第四章微甘菊原生质体制备与培养

4.1引言

4.2材料、仪器与试剂

4.2.1微甘菊细胞材料

4.2.2仪器设备

4.2.3 CPW溶液和微甘菊破壁混合酶液的配制

4.2.4原生质体培养基

4.3实验方法

4.3.1原生质体制备

4.3.2原生质体产量的测定

4.3.3活原生质体比例测定

4.3.4原生质体的培养

4.4结果与讨论

4.4.1细胞材料与原生质体制备的关系

4.4.2酶解前预处理对原生质体制备的影响

4.4.3.酶解因素对微甘菊原生质体产量和活力的影响

4.4.4微甘菊细胞破壁过程观察

4.4.5原生质体培养

4.4.6原生质体分裂生长影响因素的探讨

4.5本章小结

参考文献

第五章玫瑰茄原生质体制备与培养

5.1引言

5.2材料与试剂

5.2.1玫瑰茄细胞材料

5.2.2 CPW溶液配制

5.2.3玫瑰茄破壁混合酶液的制备

5.2.4原生质体培养基

5.3实验方法

5.3.1原生质体制备

5.3.2原生质体产量的测定

5.3.3原生质体活力测定

5.3.4原生质体的培养

5.4结果与讨论

5.4.1悬浮培养细胞系为材料进行原生质体分离的研究

5.4.2酶解前预处理对原生质体制备的影响

5.4.3.酶解因素对玫瑰茄原生质体产量和活力的影响

5.4.4原生质体分裂生长影响因素

5.5本章小结

参考文献

第六章微甘菊与玫瑰茄原生质体的非对称融合

6.1引言

6.2材料与设备

6.2.1材料

6.2.2仪器设备

6.2.3主要试剂

6.3实验方法

6.3.1原生质体预处理

6.3.2原生质体活力测定

6.3.3处理后原生质体分裂和愈伤组织再生测定

6.3.4原生质体融合

6.3.5融合体的筛选和培养

6.3.6杂种细胞的鉴定

6.4结果与讨论

6.4.1原生质体预处理

6.4.2影响原生质体融合率的因素

6.4.3融合体的愈伤组织再生

6.4.4杂种细胞的鉴定结果

6.5本章小结

参考文献

第七章杂种细胞生长与花青素积累的初步研究

7.1引言

7.2材料与试剂

7.2.1材料

7.3实验方法

7.3.1细胞生物量的测定

7.3.2花青素含量的测定

7.3.3杂种细胞的初筛

7.3.4杂种细胞的培养基和激素组合筛选

7.3.5杂种细胞与玫瑰茄悬浮培养的效果比较

7.4结果与讨论

7.4.1优良杂种细胞株的初步筛选

7.4.2适合杂种细胞生长的培养基和激素组合筛选

7.4.3杂种细胞与微甘菊细胞悬浮培养的比较分析

7.4.4杂种细胞与玫瑰茄悬细胞浮培养的比较分析

7.4.5原生质体不对称融合技术改良细胞系的可行性探讨

7.5本章小结

参考文献

结论与展望

一结论

二本论文创新之处

三展望

攻读学位期间发表的与学位论文内容相关的学术论文

致谢