非水介质中醇腈酶催化手性氰醇（S）-2-三甲基硅-2-羟基丙腈的不对称合成

摘要

光学活性氰醇是一类重要的手性合成子，由于其氰基与羟基较强的反应活性，它很容易转化为羟基酸(酯)、羟基醛(酮)、氨基酸、氨基醇和邻二醇等多种具有重大应用价值的化合物而同时保留其手性。以醇腈酶为生物催化剂催化醛、酮的不对称氰化是合成手性氰醇的一种高效、高选择性且条件温和的方法。有机硅化合物不仅在不对称合成及功能材料中占有非常重要的地位，而且具有特定的生物活性。作为药物，某些有机硅化合物比其碳结构类似物有更佳的药效、更高的选择性和更小的毒性。合成手性含硅氰醇，从而进一步合成现有药物的硅结构类似物(硅替代)是药物设计、改造的一条有效途径。近年来，离子液体替代传统有机溶剂作为反应介质和添加剂，已成功地应用于生物催化过程。研究结果表明，许多酶在离子液体中具有较高的活性、选择性及稳定性。 该文首次研究了在缓冲液/有机溶剂双相体系中来源于木薯的(S)-醇腈酶(MeHNL)催化乙酰基三甲基硅烷(ATMS)与丙酮氰醇进行不对称转氰制备(S)-2-三甲基硅-2-羟基丙腈的反应，通过对比ATMS及其碳结构类似物3，3-二甲基-2-丁酮(DMBO)的转氰反应，初步探讨了底物中的硅原子对该反应的影响机理；并研究了离子液体作为反应介质和添加剂对MeHNL和来源于杏仁的(R)-醇腈酶(PaHNL)的活性、热稳定性及对映体选择性的影响。 系统探讨了反应条件对MeHNL催化ATMS与丙酮氰醇不对称转氰的影响。该反应的最适有机相、最佳缓冲液pH、水含量(体积比)、ATMS与丙酮氰醇摩尔比、ATMS浓度、酶浓度、振荡速度和反应温度分别为异丙醚、5.4、13％、1：2、10mmol·L-1、35U/mL、190r/min和40℃。在最适反应条件下，反应初速度、底物转化率及产物对映体纯度分别为19.5mmol·L-1·h，99.0％及93.5％。 研究发现，MeHNL催化硅酮ATMS与丙酮氰醇不对称转氰反应的反应初速度、底物转化率及产物对映体纯度均大大高于其碳结构类似物的相应值。这是由于与DMBO相比，受硅原子的影响，ATMS与酶能够更紧密的结合，同时CN-对ATMS中羰基碳的进攻更为有利。对该反应的动力学参数的研究验证了以上假设。当丙酮氰醇大大过量时，该反应符合Michaelis-Menten方程，反应表观动力学参数分别为KmATMS=61.5mmol·L-1，VmaxATMS=50mmol·L-1·h，KmDMBO=161.5mmol·L-1，VmaxDMBO=16.7mmol·L-1·h，EaATMS=37kJ/mol，EaDMBO=49kJ/mol。另外两个甲基硅酮底物4-三甲基硅-3-丁炔-2-酮和4-三甲基硅氧基-3-戊烯-2-酮可能由于碳链较长，空间位阻过大不能进入酶分子的活性中心，因而MeHNL不能催化其与丙酮氰醇发生转氰反应。 与含乙腈、四氢呋喃的反应体系相比，在相同水含量下，PaHNL和MeHNL在含离子液体C4MIm·BF4的单相反应体系中均呈现出较高的催化活性和热稳定性。80℃下在C4MIm·BF4、乙腈和四氢呋喃中保存24小时后，PaHNL和MeHNL的残余活力分别为71％、22％、9％与66％，15％，4％。向缓冲液/异丙醚双相体系中添加少量的CNMIm·BF4(n=3～5)对非酶促ATMS及苯甲醛与丙酮氰醇的转氰反应有明显的抑制作用。添加适量(体积比2-6％)的离子液体CnMIm·BF4(n=3～6)能促进PaHNL催化ATMS、DMBO及苯甲醛与丙酮氰醇不对称转氰反应的速度，提高产物的对映体纯度，但添加任何浓度的四种离子液体均会降低MeHNL催化上述三种醛(酮)的转氰反应速度和产物的对映体纯度。 该项研究丰富了酶学基础理论知识，并拓展了酶的应用领域，提供了制备光学活性氰醇和有机硅化合物的行之有效的新途径。

目录

文摘

英文文摘

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第一章绪论

1.1手性化合物

1.1.1手性化合物的兴起与发展

1.1.2手性化合物的制备

1.1.3手性化合物的开发前景

1.2手性氰醇的合成及其应用

1.2.1手性氰醇的重要意义

1.2.2手性氰醇的合成

1.2.3手性氰醇的应用现状

1.3醇腈酶及其特性

1.4酶催化有机硅化合物的生物转化

1.4.1酶催化有机硅化合物的转化

1.4.2微生物细胞催化有机硅化合物的转化

1.5非水介质中的生物催化

1.5.1简介

1.5.2酶在有机溶剂中失活的原因

1.5.3含离子液体的反应介质中的生物催化

1.6本研究的主要内容及意义

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1酶源

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1粗酶的制备

2.2.2柠檬酸缓冲液的配制

2.2.3缓冲液/有机溶剂双相中MeHNL催化ATMS的不对称转氰反应

2.2.4底物中的硅原子对MeHNL催化有机硅酮不对称转氰反应的影响

2.2.5醇腈酶在含离子液体反应体系中的催化性质的研究

2.2.6气相色谱分析

2.2.7内标校正曲线

2.2.8 2-三甲基硅-2-羟基丙腈的质谱分析

2.2.9 2-三甲基硅-2-羟基丙腈的NMR分析

第三章缓冲液/有机溶剂双相中木薯醇腈酶催化(S)-2-三甲基硅-2-羟基丙腈的不对称合成

3.1缓冲液pH对缓冲液/有机溶剂双相体系中MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应的影响

3.2有机溶剂对缓冲液/有机溶剂双相体系中MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应的影响

3.3两相配比对缓冲液/有机溶剂双相体系中MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应的影响

3.4底物配比对缓冲液/有机溶剂双相体系中MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应的影响

3.5底物浓度对缓冲液/有机溶剂双相体系中MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应的影响

3.6振荡速度对缓冲液/有机溶剂双相体系中MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应的影响

3.7粗酶浓度对缓冲液/有机溶剂双相体系中MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应的影响

3.8反应温度对缓冲液/有机溶剂双相体系中MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应的影响

3.9本章小结

第四章底物中的硅原子对木薯醇腈酶催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应影响机理的初步探讨

4.1木薯醇腈酶催化含硅羰基底物转氰反应的对比研究

4.2 MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷及3，3-二甲基-2-丁酮与丙酮氰醇不对称转氰的米氏动力学参数Km及Vmax的测定

4.2.1酶浓度对MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷及3，3-二甲基-2-丁酮不对称转氰反应初速度的影响

4.2.2 MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷及3，3-二甲基-2-丁酮与丙酮氰醇不对称转氰的米氏动力学参数Km及Vmax的测定

4.2.3 MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷或3，3-二甲基-2-丁酮不对称转氰反应活化能的确定

4.3底物中的硅原子对MeHNL催化乙酰基三甲基硅烷不对称转氰反应影响机理的初步探讨

4.4本章小结

第五章反应介质中的离子液体对醇腈酶促反应的影响

5.1缓冲液-C4MIm·BF4和缓冲液-有机溶剂单相体系中醇腈酶的活性

5.2离子液体C4MIm·BF4和有机溶剂中醇腈酶的热稳定性

5.3缓冲液/异丙醚双相体系中的离子液体对醇腈酶促不对称转氰反应的影响

5.3.1缓冲液/异丙醚双相体系中的离子液体C3-6MIm·BF4对非酶促氰化反应的影响

5.3.2缓冲液/异丙醚双相体系中的离子液体C3-6MIm·BF4对PaHNL促转氰反应的影响

5.3.3缓冲液/异丙醚双相体系中的离子液体C3-6MIm·BF4对MeHNL促转氰反应的影响

5.4本章小节

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢

附录一色谱图

附录二羰基底物的内标校正曲线

附录三2-三甲基硅-2-羟基丙腈的物质结构鉴定