菲高效降解菌的驯化、分离、鉴定及其降解菲的特性与机理研究

摘要

多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是一类广泛存在于环境中的有机污染物。大多数的多环芳烃具有“三致”作用，通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害，因而这类化合物引起了环境学家们的关注。如何利用微生物的降解作用将其从环境中去除已成为人们研究的热点问题。 本论文以菲为多环芳烃生物降解研究的模型物，主要研究内容包括：(1)多环芳烃菲降解菌的驯化、筛选和分离；(2)降解菌株GY2B的鉴定、抗生素敏感性试验以及质粒的提取试验；(3)菲的降解特性研究，以及温度、pH、外加营养物质和初始底物浓度等因素对菌株GY2B的生长和菲降解的影响；(4)菲降解菌的底物降解范围研究；和(5)菲生物降解中间产物的分析及其代谢途径的推导。 选用水-硅油双相体系和单一水相体系两种方法来驯化多环芳烃降解菌。结果发现水-硅油双相体系筛选出的三种混合菌系：GY2、GS3和GM2对菲的降解效果要好于单一水相体系筛选出的菌。进一步研究确认这三种混合菌系在72h能分别降解99.9﹪、99.9﹪和91.9﹪的菲(初始浓度100mg/L)。通过平板涂布与划线，从混合菌GY2中分离出一株菲高效降解菌GY2B，48h对菲的降解率达到99.1﹪。 镜检表明菌株GY2B为革兰氏阴性无芽孢杆菌，16SrDNA序列分析表明其和鞘氨醇单胞菌的同源性最高，初步鉴定它为Sphingomonassp.GY2B，该菌株的GenBank登陆号是DQ139343。菌株GY2B对四种常用的抗生素：头孢呋辛、氯霉素、红霉素和四环素表现敏感，对羟氨苄青霉素中度敏感。且菌株GY2B没有明显的质粒DNA条带。 菌株GY2B的最佳生长温度是25～30℃，最佳pH值范围是7.1～7.4，对菲的降解在pH值7～10范围内都比较高。试验表明添加低浓度的蛋白胨或葡萄糖对细胞的生长和菲的降解都有一定促进作用，而葡萄糖的作用似乎更明显一些。但高浓度葡萄糖(≥500mg/L)的加入对细胞生长会产生毒害作用。 当菌株GY2B以10、60和100mg/L初始浓度的菲为唯一碳源时，48h菲的降解率均在99﹪以上，而230mg/L初始浓度下菲的降解率只有70﹪左右，此后菲浓度基本不再减少，到120h仍有大量的菲残留，此时菌株GY2B的细胞也大量死亡。进一步研究证实了高初始浓度(250mg/L)的菲样品中积累了一种中间产物——1-羟基-2-萘酸，之后的研究表明高浓度的1-羟基-2-萘酸对菌体细胞有抑制作用。另外，通过计算菌株GY2B在不同菲初始浓度下的比生长速率μ(对数生长期)发现底物菲的初始浓度和菌株的比生长速率μ之间没有显著的相关性。 底物降解范围实验表明：菌株GY2B能够以一定浓度的萘、菲、1-羟基-2-萘酸、2-萘酚、水杨酸、邻苯二酚、苯酚、苯和甲苯为唯一碳源和能源进行生长和繁殖，但不能利用和降解低浓度的1-萘酚、邻苯二甲酸和对苯二酚为唯一碳源生长。同时，菌株GY2B在降解水杨酸、1-羟基-2-萘酸和萘的过程中都有中间产物2-羟基粘康酸半醛，而降解邻苯二酚的过程有产物己二烯二酸。 试验还发现菌株虽然不能利用1-萘酚为唯一碳源生长，且1-萘酚对细胞有抑制作用，但是当一定浓度的1-萘酚和一定浓度的菲共存时，菌株GY2B能利用和降解部分的1-萘酚。 UV-Vis分析发现混合菌GY2和菌株GY2B降解菲的产物中有羟基与芳香环相连的结构以及酚酮结构的化合物。另外还证明菌株GY2B降解菲的过程中有1-羟基-2-萘酸和2-羟基粘康酸半醛这两种中间产物的产生。GC-MS分析发现菌株GY2B代谢菲的时候有中间产物水杨酸，1-萘酚和1-羟基-2-萘酸，以及微量的1-羟基-2-萘醛和1-羟基-2-萘酸甲酯。而混合菌GY2的代谢物中除没有水杨酸外，其余产物和菌株GY2B的一样。 通过底物降解范围试验、UV-Vis和GC-MS分析，推导出菌株GY2B降解菲的途径如下：在菌株GY2B的作用下，菲先开环生成1-羟基-2-萘酸甲酯和1-羟基-2-萘醛，然后转化成1-羟基-2-萘酸，经脱羧成为1-萘酚，再开环后生成水杨酸，通过邻苯二酚间位途径裂解生成2-羟基粘康酸半醛，最后进入三羧酸循环(TCA)彻底降解为二氧化碳和水。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1多环芳烃的性质与来源

1.1.1多环芳烃的化学结构、理化性质和毒性

1.1.2多环芳烃的来源

1.2不同环境介质中多环芳烃

1.2.1大气中的多环芳烃

1.2.2水体中的多环芳烃

1.2.3土壤中的多环芳烃

1.2.4植物中的多环芳烃

1.2.5环境中多环芳烃的存在状态和行为

1.3多环芳烃的生物降解研究进展

1.3.1降解多环芳烃的微生物的调查

1.3.2降解多环芳烃微生物的筛选

1.3.3多环芳烃生物降解特性的研究方法

1.3.4降解多环芳烃的微生物资源

1.3.5多环芳烃生物降解影响因素的研究

1.3.6多环芳烃微生物降解机理研究

1.3.7多环芳烃生物降解研究中存在的主要问题

1.4本论文研究的意义和内容

1.4.1本论文研究的意义

1.4.2本论文研究的内容

第二章菲降解菌的驯化、筛选和分离

2.1实验材料与方法

2.1.1主要仪器

2.1.2样品来源

2.1.3主要试剂

2.1.4主要培养基

2.1.5样品的预处理

2.1.6降解菌系的驯化和筛选

2.1.7菌株的划线分离

2.2实验结果

2.2.1菌种驯化结果

2.2.2菌种分离结果

2.3本章小结

第三章降解菌株GY2B的鉴定

3.1实验材料与方法

3.1.1主要仪器

3.1.2主要试剂

3.1.3形态学和生理生化特性分析

3.1.4 API鉴定

3.1.5 16S rDNA序列分析

3.1.6抗生素敏感性测定

3.1.7质粒DNA提取和检测方法

3.2结果与讨论

3.2.1普通生化试验

3.2.2 API鉴定结果

3.2.3 16S rDNA序列分析结果

3.3.4菌株GY2B系统发育分析

3.2.5菌株GY2B的抗生素敏感性

3.2.6质粒提取结果

3.2.7混合菌种及纯菌的保藏

3.3本章小结

第四章菲的降解特性研究

4.1实验材料与方法

4.1.1主要仪器

4.1.2主要试剂

4.1.3微生物的生物量的测定方法

4.1.4菲的萃取方法

4.1.5菲的测定方法

4.1.6三种混合菌降解菲和菌生长率测定

4.1.7混合菌GY2及纯菌GY2B对菲的降解特性

4.1.8环境因素对纯菌GY2B生长及菲降解的影响

4.2结果与讨论

4.2.1菲的气相色谱检测方法与标准曲线

4.2.2萃取方法回收率

4.2.3三种混合菌对菲的降解情况

4.2.4混合菌GY2及纯菌GY2B对菲的降解特性

4.2.5菌株GY2B长时间的生长曲线

4.2.6环境因素对菌株GY2B生长和降解菲的影响

4.3本章小结

第五章降解菌的底物降解范围研究

5.1实验材料与方法

5.1.1主要仪器

5.1.2主要试剂

5.1.3底物降解范围试验方法

5.1.4菲对菌株GY2B降解1-萘酚的影响

5.1.5分析方法

5.2结果与讨论

5.2.1混合菌在不同底物上的生长情况

5.2.2菌株GY2B在不同浓度的不同底物中的生长情况

5.2.3不同浓度的不同底物的降解情况

5.2.4菲对菌株GY2B降解1-萘酚的影响

5.3本章小结

第六章菲降解中间产物和代谢途径的研究

6.1实验材料与方法

6.1.1主要仪器

6.1.2菲降解中间产物的分离

6.1.3分析方法

6.2结果与讨论

6.2.1混合菌GY2和纯菌GY2B降解菲的UV-Vis分析

6.2.2混合菌GY2和纯菌GY2B降解菲的质谱分析

6.2.3菌株GY2B降解菲过程的UV-Vis图谱分析

6.2.4菌株GY2B降解菲过程的质谱分析

6.2.5菌株GY2B降解菲的途径探讨

6.3本章小结

结论

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文及申请的专利情况

致谢