一种菲污染土壤降解菌及其在菲污染土壤修复中的应用

摘要

本发明公开一种菲污染土壤降解菌及其在菲污染土壤修复中的应用。通过通过在克拉玛依油田石油污染土壤样品进行菌种的筛选，获得具有菲污染土壤修复作用的菌株，经过进一步筛选、驯化选育，以及对所获菌株进行形态特征及16SrRNA序列测定及系统发育分析，确定了细菌y-8为弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)CGMCC No．6763，对菲降解性能进行测定，并对其在菲污染土壤生物修复方面进行了深入研究，在菲污染土壤修复中具有突出的技术效果。

说明书

技术领域

本发明涉及土壤修复微生物应用技术领域，具体说，本发明涉及一种菲污染土壤降解菌及其在菲污染土壤修复中的应用的技术领域。 

背景技术

多环芳烃(PAHs)是指两个或两个以上芳环稠和在一起的一类化合物，普遍存在于环境中。具有强致癌性，致突变性及致畸性，对微生物生长有强抑制作用，而且多环芳烃经紫外光照射后毒性更大。美国环保局早在上世纪八十年代初便把l6种未带分支的多环芳烃确定为环境中的优先污染物，我国也早把多环芳烃列入环境优先监测的污染物黑名单。多环芳烃的来源有两种，天然源和人为源。随着工业进程的加速，多环芳烃菲(PAHs)具有典型的多环芳烃的结构，是土壤、河水及沉积物中常见的污染物之一。工业上多环芳烃菲可用作染料、杀虫剂、塑料，炸药以及药物，多环芳烃菲是国际上公认的须首先加以控制的有机化合物之一。当前多环芳烃菲已成为对多环芳烃降解研究中的模式化合物。不同于高分子量的多环劳烃，多环芳烃菲没有致癌和致突变作用，所以对人不会造成伤害，但是菲对水生生物鱼类和藻类等有一定毒性，可通过食物链进入人体，危害人类健康。多环芳烃已成为中国土壤环境中较为常见的一类重要的有机污染物，其污染程度仍在不断加剧，直接影响到土壤性能和农产品安全。土壤中多环芳烃污染的主要途径有污水灌溉，大气沉降、废物倾倒和工业渗漏。污水灌溉是我国土壤多环芳烃污染的最主要方式。 

活性炭吸附、有机溶剂萃取和表面活性剂清洁等非生物处理方法能在一定程度上控制PAHs污染扩散，是现场急救的有效措施，但是还没有从根本上解决 PAHs污染。大量的试验和现场处理结果表明依靠植物，尤其是微生物的生物降解是经济、高效、彻底、省时快速去除有机物污染的好方法。生物修复(bioremediation)是在生物降解基础上发展起来的一种新兴清洁技术，与其它清洁技术相比较有二次污染较少，价格低等优点，已成为去除多环芳烃的重要手段。植物和微生物是常见的生物修复主体，在去除环境污染物方面发挥重要作用。 

微生物在去除环境污染物方面发挥重要作用，以微生物为主的生物修复技术研究和应用一直是最活跃的领域。能被微生物降解的有机污染物有许多，Tabak等人在1981年报道了114种单环、多环、卤代芳烃、有机氯杀虫剂等能被微生物降解和转化的多环芳烃。通过富集培养技术目前已经从被PAHs污染的沉积物中分离到许多具有较强降解能力的细菌、放线菌、真菌和藻类微生物。细菌在PAHs降解过程中占主导地位，尤其是对低分子量PAHs的降解。 

目前，微生物修复作为降解和在菲污染土壤修复中具有的作用日益受到重视。报道较多的生物治理技术主要有就地处理，现场处理和生物反应器三种。可通过接种微生物、添加营养盐、提供电子受体以及添加表面活性剂等方法促进菲污染土壤的微生物修复率。现场处理的多环芳烃的降解率大于就地处理，现场处理对低分子量的多环芳烃的降解作用明显。生物反应器对土壤中的低分子量的多环芳烃也有较为好的降解率。微生物修复往往需要向土壤中引入外源微生物，这些被引入的专性降解菌或基因工程菌降解多环芳烃的效果易受到土著微生物竞争的影响，而且外源菌的引入也存在潜在的土壤生态风险。微生物对污染物的降解能力常取决于微生物暴露于污染物时间的长短。为了提高多环芳烃的生物降解速率，常常需要从受污染的环境中分离并富集培养降解速率最大的微生物种类，然后再把它们用于污染环境的生物治理。 

发明内容

针对现有技术中菲污染土壤修复微生物菌种的研究的现状，本发明旨在提供一种菲污染土壤降解菌弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)，并通过试验验证，采用本发明提供的弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)具有修复菲污染土壤作用。 

本发明采用主要的技术方案： 

通过在克拉玛依油田石油污染土壤样品进行菌种的筛选，获得具有对菲污染土壤进行修复作用的菌株，经过进一步筛选、驯化选育，获得一株降解菌株编号y-8。通过对所获菌株进行形态特征及16S rRNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位；同时应用该细菌y-8对菲降解性能进行测定，并对其在菲污染土壤生物修复方面进行了深入研究，在菲污染土壤修复中具有突出的技术效果。 

具体的，本发明提供的一种菲污染土壤降解菌弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)，命名为y-8。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2012年11月02日，保藏号是CGMCC No.6763。经微生物学鉴定为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)。该菌株的形态为无芽孢杆菌，革兰氏染色阴性，在LB平板上30℃培养24h，菌落特征为粉色，呈规则圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，易挑起。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，sManual of Systematic Bacterio-logy》)和《常用细菌系统鉴定手册》对y-8菌株进行形态学测定，生理生化检测确定y-8菌株为弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)中的成员。通过BLAST同源比对，菌株y-8的16S rRNA序列在NCBI 数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树，菌株y-8与Pseudomonasgeniculata是其近似种，因而根据16S rDNA序列分析结果，结合形态及生理生化特性，将菌株y-8鉴定为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)。 

进一步，本发明提供菌弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)在菲污染土壤降解的应用。 

本发明进一步提供了菌种的保存条件，采用LB固体培养基，30℃条件下培养14-16小时，后采用无菌脱脂牛奶为保护剂，真空冷冻干燥后低温保存。LB培养基为本领域常用和常见的培养基。 

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果： 

本发明提供了分离得到的弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)CGMCCNo．6763，该菲污染土壤降解菌在菲污染土壤修复中具有积极作用。 

附图说明

图1显示为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)CGMCC No．6763的电子显微镜照片。 

图2显示为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)CGMCC No．6763的生长曲线图。 

图3显示为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)CGMCc No．6763的16srRNA系统发育树图。 

图4显示为弯曲假尊胞菌(Pseudomonas geniculata)CGMCC No．6763菌株以100mg／L菲为唯一碳源和能源的生长及菲的降解曲线图。 

图5显示为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)CGMCC No．6763菌株以500mg／L菲为唯一碳源和能源的生长及菲的降解曲线图。 

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。 

本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备： 

培养基及其它材料：采用水．硅油按体积比4∶1组成体系，水相无机盐培养液成分包含基础培养液和1.0ml／L微量元素液，其中基础培养液的组成为：(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，Na₂HPO₄ 0.5g／L，MgSO₄．H₂O 0.3g/L。其中微量金属液的组成为：FeCl₃ 0.3g／L，FeSO₄．7H₂O 0.3g／L，MnSO₄．H2O 0.15g／L，ZnSO₄0.14g／L，COCl₂ 0.2g／L。 

主要仪器与试剂：恒温培养箱，紫外分管光度计，高效液相色谱仪。 

本发明中选用的所有菌种和原辅材料，以及选用的菌种培养条件和方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。 

本发明中，除非特别指明，术语“碳源”是指微生物可利用的含碳物质，微生物利用该含碳物质合成自身细胞的含碳物质。术语“能源”是微生物细胞可氧化其产生电子，在电子传递过程中产生ATP供细胞利用的物质。 

实施例一：弯曲假单胞茵(Pseudomonas geniculata)CGMCC No．6763的分离、筛选与鉴定 

在克拉玛依油田石油污染土壤取样品，取5g土壤样品于50mL菲无机盐培养基中，30℃，１50r／min振荡培养，以OD600＝0.6-0.8(细菌处于对数生长期)之间时，移取1mL培养液加入到p(菲)为100mg／L的60mL水一硅油双相体系培养基中，水-硅油按体积比4∶1组成双相体系，在30℃，150r／min避光振荡培养。待培养液OD600值为0.6-0.8时，移取1mL培养液，加入到新配制的含菲无机盐培养基中。重复以上步骤，共富集培养8代。 

取富集后的培养液1mL，制作菲平板，30℃温箱培养7d，挑取能产生透 明圈的单菌落纯化。将挑选的菌落在牛肉膏蛋白胨固体培养基上反复划线，30℃温箱培养，待菌落充分生长后，挑选不同形态的菌落重新接种到含菲的无机固体培养基进行驯化，如此反复纯化5代。 

本发明从克拉玛依油田石油污染土壤中取样，筛选的具体步骤是：将样品在富集培养基中富集培养24h，再涂布于筛选培养基平板上；经过平板筛选，共分离获得12株多环芳烃降解菌株；经过进一步复筛，得到降解菌株y-8。 

参见附图1，本发明筛选得到的菌株，参照伯杰氏手册进行生理生化测定，菌株的形态为无芽孢杆菌，革兰氏染色结果为阴性，在LB平板上30℃培养24h，菌落特征为粉色，呈规则圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，易挑起。 

挑取少量单菌落，放入盛有25μL无菌水的EP管中，100℃煮沸8-10min，后迅速放入冰水混合物中5min。离心10000r／min、5min，4℃保存，用时取上清。以提取到的细胞总DNA为模板，PCR扩增16SrRNA序列。 

PCR扩增反应体系为50μL,含有24μLpremix Taq，引物11μL，引物21μL，模板2μL，无菌水22μL。扩增条件：94℃ 4 min，94℃ 55s，53℃ 30s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 7min。扩增产物(约1500 bp)经1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR产物直接进行双向测序，经测序后确认该片段实验长度为1447bp。根据16SrRNA序列分析结果，结合形态及生理生化特性，将菌株y-8鉴定为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)。 

将上述菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2012年11月02日，保藏号是CGMCC No．6763。经微生物学鉴定为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)。 

依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of SystematicBacterio-logy》)和《常用细菌系统鉴定手册》对y-8菌株进行形态学测定，生理生化检测，参见附图2，确定y-8菌株为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)中的成员。通过BLAST同源比对，菌株y-8的16S rRNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树，参见附图3，菌株y-8与Pseudomonasgeniculata ATCC 19374(T)是其近似种，因而根据16S rDNA序列分析结果，结合形态及生理生化特性，将菌株y-8鉴定为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)。 

本发明的y-8菌株生物学特性如表1所示。 

表1：菌株Y-8的生理生化特性 

将y-8的16S rRNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树，参见附图3所示。y-8的16s rRNA序列进行BLAST分析，结果显示，y-8与菌株Pseudomonas geniculata ATCC 19374(T)的相似性最高，达到了99.485％。确定y-8为弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)。 

实施例二：弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)CGMCC No．6763的生长因子 

参见如下方式，但是应根据本发明提供的弯曲假单胞菌(Pseudomonasgeniculata)CGMCC No．6763特性确定其具体的生长因子。 

把菌株y-8经培养，结果见表2得出，菌株y-8最适合生长因子。 

表2：温度、pH、盐、抗生素时菌株y-8生长的影响 

温度(℃) 4 10 15 20 25 30 生长情况 + + + ++ +++ ++++ 温度(℃) 35 40 45 50 55 60 生长情况 ++ + + - - -

[0043] 

pH 1 2 3 4 5 6 生长情况 - - - - + + pH 7 8 9 10     生长情况 ++ + + +     NaCl浓度 0.5％ 1％ 2％ 3％ 4％ 5％ 生长情况 + ++ ++ ++ + - NaCl浓度 6％ 7％ 8％ 9％ 10％   生长情况 - - - - -   氨苄青霉素μg／ml 50 60 70 80 90 100 生长情况 + - - - - -

实施例三：弯曲假单胞茵(Pseudomonas geniculata)CGMCC No.6763对菲降解性能的测定 

将弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)CGMCC No.6763接种至含菲100mg／L的无机盐培养基中，在150rpm／min，30℃摇床避光震荡培养，在第0、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80h分别取样测定培养液中菌密度和菲残留率，实验结果参见附图4。由附图4的菲降解曲线可以看出，在100mg／L的初始浓度下，开始阶段0-16h降解缓慢，接下来的16-64h之间菲的降解非常快，到72h的时候，菲的降解量已经达到91.22mg。另外，参见附图4的细胞生长曲线表明降解初期细胞生长有一点缓慢，之后的生长较快。将PseudomonasgeniculataY-8接种至含菲500mg／L的无机盐培养基中，在150rpm／min，30℃摇床避光震荡培养，在第0、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80h分别取样测定培养液中菌密度和菲残留率，实验结果参见附图4。参见附图5的菲降解曲线可以看出，在500mg／L的初始浓度下，开始阶段0-16h降解缓慢，接下来的16-64h之间菲的降解非常快，到72h的时候，菲的降解量已经达到415.85mg。菌株Y-8随着菲初始浓度增加，降解量呈一定程度增加。当菲初始浓度为1000-3000mg／L区间时，降解速度明显变慢，且与菲浓度增加呈负相关，可能为菲浓度过大，毒害菌体所致。 

实施例四：弯曲假单胞茵(Pseudomonas geniculata)CGMCC No.6763菲污染土壤修复的验证 

该株微生物具有降解多环芳烃菲的能力，可以用于土壤中多环芳烃的降解， 

根据Monod模型，推导出y-8菌的生长动力学方程模型。以细胞浓度大小来描述细胞生长的速率： 

由假设可得细菌成分用一个参数即菌体浓度X随时间的变化表示： 

$\frac{\mathrm{dX}}{\mathrm{dt}}=\mathrm{\mu X}---\left(1\right)$

y-8菌的生长如下： 

$\mu =\frac{{\mu }_{m}S}{K+S}---\left(2\right)$

将(2)式代入(1)式，得 

$\frac{\mathrm{dX}}{\mathrm{dt}}=\mu =\frac{{\mu }_m\mathrm{SX}}{K+S}---\left(3\right)$

设Y为得率系数，即每氧化1克的菲所产生的细菌质量(ug/g)，y-8菌的生长速度与菲消耗，被y-8菌氧化，速度存在比例关系： 

$\frac{\mathrm{dX}}{\mathrm{dt}}=\frac{\mathrm{YdS}}{\mathrm{dt}}---\left(4\right)$

将(3)、(4)两式联系起来，得 

$\frac{\mathrm{dS}}{\mathrm{dt}}=-\frac{{\mu }_m\mathrm{SX}}{Y(K+S)}---\left(5\right)$

令X₀和S₀分别为初始得细菌浓度和底物的菲浓度，由(5)式有 

X=X₀+Y(S₀-S)(6) 

式(6)以基质底物菲来表示y-8生长响应模型式微分方程。化简得： 

$\frac{\mathrm{ds}}{\mathrm{dt}}=-\frac{{\mu }_m[X_0+Y(S_0-S)]S}{Y(K+S)}---\left(7\right)$

式(7)经底物(菲)浓度为变量的生长动力学模型。 

对(7)式直接进行积分： 

${\int }_0^t{\mu }_m\mathrm{dt}=-{\int }_{S_0}^{S_t}\frac{Y(K+S)}{X_0+Y(S_0-S)}\mathrm{ds}---\left(8\right)$

y-8菌生长动力学方程的数值求解 

设h．=代入公式(8)，解该积分式得到式(9) 

${\mu }_{m}t=\ln \frac{S-(X_0/Y+S_0)}{S-(X_0/Y+S_0)}+\frac{K}{X_0/Y+S}[\ln \left(\frac{S-(X_0/Y-S_0)}{S}\right)-\ln \left(\frac{S_0-X_0/Y-S_0}{S_0}\right)]$

今R₀=X₀／Y+S₀，代入(9)式，即建立y-8菌生长动力学参数的目标函数方程式(10) 

$F\left(S\right)=\frac{K}{R_0}\ln \frac{S_0(S-R_0)}{S(S_0-R_0)}+\ln \frac{S-R_0}{S_0-R_0}-{\mu }_{m}t---\left(10\right)$

上式就是菲浓度(底物浓度)来表述的y-8菌生长动力学方程，表明了生长速率与底物浓度之间的对应关系。 

K，R₀，um为实验数据，S₀，S，t为方程中的3个参数。取指数生长期内3组实验数据，可由目标函数方程式得到一个三元非线性方程组。借助Matlab计算工具软件，得用Newton迭代法求解上述方程组，计算时赋给三个所求常数一组初始值，计算程序经过多次循环迭代，最后给出一组满足精度的数值解，从而可得到初始条件下生长动力学方程组数值解，确定了初始生长条件下以限制性底物菲为表征的生长动力学方程。 

表3菲底物浓度与细晌浓度随时间的变化 

基质质量浓度(g／L) 1.5 1.443 1.255 1.018 0.763 0.567 0.492 细菌OD值 0.2 0.232 0.435 0.697 0.902 0.912 0.865 时间(h) 0 2 4 6 8 10 12

表4不同初始条件下菌株y-8的生长动力学参数计算值 

按牛顿法程序运行软件，得到菌株y-8的动力学生长响应模型是 

K＝0.8562 Umax＝0.1174R₀＝13.6059 

$F\left(S\right)=\frac{0.8562}{13.6059}\ln \frac{S_0(S-R_0)}{S(S_0-R_0)}\ln \frac{S-R_0}{S_0-R_0}-0.1174t$

选取表3中指数生长期内3组实验数据构建三元非线性方程，借助Matlab软件，同时采用Newton迭代法求解上述方程组进行计算，从而可得到不同初始条件下生长动力学方值程组数如表4所示，确定不同初始生长条件下限制性底物菲的降解情况。 

根据Long等的研究，环境中PAHs的浓度若低于生物影响范围低值，对生物的毒副作用不明显；PAHs的浓度若高于生物影响范围中值，对生物会产生毒副作用，菲在土壤中的浓度为0.24ug/g时，为生物影响范围低值，为1.5ug／g时，为生物影响范围中值，由此例我们可以看出，当菲污染土壤修复至第8天时，已低于生物影响范围中值，此明玉米发芽率和蚯蚓死亡率有显著变化，当到过11天时，已低于生物影响范围低值，此时玉米发芽率和蚯蚓死亡率说明土壤基本修复成功，对生物影响较小，各指标正常。