燃料酒精多种抗性酵母菌种的选育

摘要

本研究主要采用EMS诱变，进化工程(Evolutionary Engineering)和基因组改组(Genome Shuffling)等方法选育对酒精，高温以及对蔗渣酸水解物中的代表性毒性物质具有多种抗性的酒精酵母。 烷化剂EMS主要诱发基因组中G/C到A/T转换，利用其处理酵母细胞以增加突变率，差异的产生是后续选择以及融合的基础。进化工程(Evolutionary Engineering)指的是通过合理应用适当的诱变和连续筛选程序，以改良微生物特定的性状为目标的菌种改良方法。基因组改组(Genome Shuffling)以原生质体融合为技术平台，以多亲本多轮递推式融合为特色，在细胞群体层次上对基因组进行反复重组、选择。 利用EMS诱变，结合8轮酒精冲击，逐渐增加选择压力来选育耐酒精菌株。在此基础上，采用连续驯化的方法得到耐糠醛以及羟甲基糠醛的群体。酒精冲击所得的群体P1在18％(v/v)的酒精存在下培养72h的存活率为58.53％，而出发菌株仅为4.94％。连续驯化后得到的群体P2能在30mmol/L糠醛或者30mmol/L羟甲基糠醛中正常生长和发酵。 采取双亲灭活标记方法，整合酒精酵母多种优良性状：耐高温，耐酒精以及耐受糠醛和羟甲基糠醛。然后再通过两轮原生质体融合，以高温平板为筛选条件进一步筛选耐高温的菌株。融合子F305的致死温度提高到73℃，而融合亲本P1和P2分别为51℃和60℃。 该融合子能在44℃平板生长，在38℃高温下液体培养基中正常生长，38℃条件下对甘蔗汁的发酵率为69.15％，比融合亲本P1和P2分别提高了15.13％和13.02％。融合子F305的继承了融合亲本P1的耐酒精性能，并且在15mmol/L的糠醛和15mmol/L 的羟甲基糠醛加上35℃高温的双重压力下能正常发酵，发酵效率达78.05％。 利用絮凝酵母生产酒精，可以降低生产成本和对环境压力。发酵后期可以通过简单的沉降工艺来回收酵母。对利用回收的废酵母制备酵母提物进行了研究，为将来利用絮凝酵母生产燃料酒精做有益的准备。外加蛋白酶和溶壁酶可以提高水解物氨基氮和固形物的水平。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1燃料酒精发展概况

1.2燃料酒精生产过程存在的共性技术难题

1.3工业菌种的选育方法

1.4酒精工业与资源环境

1.5本研究的意义和内容

第二章耐酒精及糠醛和羟甲基糠醛酵母的选育

2.1耐酒精菌株的选育

2.1.1概述

2.1.2材料与方法

2.1.3结果与讨论

2.2耐糠醛和羟甲基糠醛酵母的选育

2.2.1概述

2.2.2材料与方法

2.2.3结果与讨论

本章小结：

第三章利用基因组改组技术选育耐高温酵母

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.3结果与讨论

本章小结

第四章废酵母抽提物制备工艺优化研究

4.1概述

4.2材料与方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1外加蛋白酶效果试验

4.3.2外加溶壁酶对酵母自溶的影响

4.3.3外加酶和复合促进剂对自溶的影响

4.3.4自溶时间的影响

本章小结

结论与展望

1.结论

2.创新点

3.展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢

评定意见