有机溶剂高耐受性酵母菌株的选育及细胞适应性机制研究

摘要

有机溶剂对微生物细胞的生理和代谢有一定的毒害作用,成为制约非常规介质中进行细胞生化反应的瓶颈。维持细胞高活性,筛选对有机溶剂的抗性或耐受性高的细胞,是提高生物催化的重要因素。因而探讨有机溶剂对细胞的毒性作用及细胞的自我调节适应性机制已成为研究的重点。 本文首先比较了10种常见的有机溶剂对酿酒酵母细胞的毒性作用,发现不同有机溶剂对细胞的毒性大小不同,而有机溶剂的化学性质和极性共同决定着有机溶剂对酵母细胞的毒性。然后选择乙醇和丙酮这两种有机溶剂作为选择压力,筛选出了具有较强耐受性的酵母菌株Y-c-8和B-g-5,并对其生理生化特性进行了研究。 通过胞外核苷酸浓度的测定,发现有机溶剂耐受性菌株的细胞膜通透性较出发株明显增大。透射电子显微镜观察到Y-c-8和B-g-5细胞结构发生了较大改变。虽然细胞膜界限仍很清晰,结构较完整,但整个细胞变小,细胞形态有皱缩,且细胞外层结构呈现单层,颜色变深,周围分散着大量颗粒。 采用皂化法测定麦角固醇含量,发现麦角固醇的含量与细胞对有机溶剂的耐受性成正比例关系,即对乙醇和丙酮的耐受性越强,其细胞麦角固醇的含量越高,最终两株有机溶剂高耐受性菌株Y-e-8和B-g-5的麦角固醇含量分别达到0.563％和0.591％,较出发株提高了30.32％和36.81％。 对出发株、Y-c-8和B-g-5的细胞内脂肪酸组成进行分析测定。三株菌的细胞脂肪酸组成有很大差异。两株耐受性菌株中长链脂肪酸含量明显增加,短链脂肪酸甚至停止合成,最终长链多烯脂肪酸的含量占据总脂肪酸的一半左右,脂肪酸的不饱和度大大增加。 本论文通过筛选有机溶剂高耐受性菌株并对其生理生化特性进行了研究,测定细胞膜通透性的变化,进而对细胞适应性机制麦角固醇含量和细胞脂肪酸组成进行了研究,为非水相介质中微生物细胞的利用奠定了基础。

目录

文摘

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第一章绪 论

1.1有机溶剂对细胞的毒性作用

1.2有机溶剂耐受性菌株的选育

1.3酵母细胞对有机溶剂适应机制的研究进展

1.3.1酵母有机溶剂耐受性与细胞膜通透性的关系

1.3.2酵母有机溶剂耐受性与麦角固醇的关系

1.3.3酵母有机溶剂耐受性与细胞脂肪酸的关系

1.4本课题的研究目的和研究内容

第二章有机溶剂对酵母细胞毒性的研究

2.1前言

2.2材料与设备

2.2.1主要仪器设备

2.2.2主要试剂

2.2.3实验菌种

2.2.4培养基和常用溶剂配制

2.3实验方法

2.3.1培养方法

2.3.2酵母培养及计数

2.4结果与讨论

2.4.1不同有机溶剂种类及logP值

2.4.2不同有机溶剂对酵母菌的存活率的影响

2.4.3有机溶剂毒性及极性对酵母耐有机溶剂能力的影响

2.5本章小结

第三章乙醇、丙酮耐受性菌株的筛选及生理生化性质研究

3.1前言

3.2材料与设备

3.2.1主要仪器设备

3.2.2主要试剂

3.2.3实验菌种

3.2.4培养基和常用溶剂配制

3.3实验方法

3.3.1乙醇、丙酮耐受性酵母菌株的初步筛选

3.3.2酵母菌富集驯化培养及平板分离复筛

3.3.3生物量的测定

3.4结果与讨论

3.4.1乙醇、丙酮耐受性菌株的筛选

3.4.2出发株与有机溶剂高耐受性菌株的生理生化性质比较研究

3.5本章小结

第四章酵母有机溶剂高耐受性与细胞膜通透性的关系研究

4.1前言

4.2材料与设备

4.2.1主要仪器设备

4.2.2主要试剂

4.2.3实验菌种

4.2.4培养基和常用溶剂配制

4.3实验方法

4.3.1胞外核苷酸浓度的测定

4.3.2透射电镜样品前处理

4.4结果与讨论

4.4.1有机溶剂冲击下不同菌株胞外核苷酸浓度的变化

4.4.2透射电镜观察不同酵母菌株的细胞形态的变化

4.5本章小结

第五章酵母有机溶剂高耐受性与麦角固醇含量变化的研究

5.1前言

5.2材料与设备

5.2.1主要仪器设备

5.2.2主要试剂

5.2.3实验菌种

5.2.4培养基和常用溶剂配制

5.3实验方法

5.3.1麦角固醇含量的测定

5.3.2生物量的测定

5.3.3麦角固醇产量的计算

5.4结果与讨论

5.4.1麦角固醇标准曲线的制作

5.4.2酵母中麦角固醇的合成

5.4.3酵母有机溶剂高耐受性与麦角固醇合成的关系

5.5本章小结

第六章酵母有机溶剂高耐受性与细胞脂肪酸组成变化的研究

6.1前言

6.2材料与设备

6.2.1主要仪器设备

6.2.2主要试剂

6.2.3实验菌种

6.2.4培养基和常用溶剂配制

6.3实验方法

6.3.1菌体的培养

6.3.2皂化

6.3.3甲基化

6.3.4抽提

6.3.5碱洗

6.3.6气相色谱检测条件

6.3.7各种脂肪酸的色谱峰命名

6.4结果与讨论

6.4.1各种脂肪酸保留时间的确定

6.4.2出发株和有机溶剂高耐受性菌株细胞脂肪酸的分析

6.5本章小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士期间取得的研究成果

致谢