纤维素酶的家族分析、分子改造设计和计算机模拟

摘要

纤维素酶随机水解纤维素主链的β-1,4-糖昔键,广泛应用在工业生产领域,同木聚糖酶联合使用可以用来转化环境友好燃料-乙醇,利用自然界的可再生资源：纤维素和半纤维素。然而工业生产条件往往比较苛刻,使得纤维素酶的利用受到很大限制。除了筛选合适菌种外,人们希望利用蛋白质工程手段改造纤维素酶性质。这就需要了解蛋白质序列同蛋白质功能和空间结构的相关知识。本文用计算机分子模拟方法对纤维素酶进行了家族分析和分子改造设计。 首先,从Swiss-prot蛋白质数据库中收集家族5纤维素酶蛋白质序列,从相关文献中查找每一条纤维素酶序列的最适温度和最适pH值,挖掘具有耐碱特性和耐高温特性的极端纤维素酶。同时,从PDB蛋白质结构数据库中收集已经测得晶体结构的纤维素酶。对家族5的49个纤维素酶建立进化树,进行亚家族分类,以每个亚家族中结构功能较清楚的酶为参照对象分析亚家族内的酶,得出与温度适应性和pH适应性有关的结构特征,将这些特征作为后面分子改造的理论依据。 然后,通过对Humicola inslens EGV和与它同源的耐热酶进行序列结构的分析,比较环区、二硫键、氢键、离子键、疏水作用、二级结构稳定性等差异,结合以上总结的耐热酶结构特征确定了改造EGV耐热性的定点突变体。 最后,通过计算机模拟技术模拟突变体,分析二级结构稳定性、二硫键、离子键、疏水作用、溶剂可及性、底物作用等变化综合各项评分筛选出构象最合理的突变体进行下一步的实验操作。 本文利用家族同源分析挖掘极端特性纤维素酶的序列结构特征,归纳出对热稳定性、pH稳定性有利的氨基酸位点和特殊结构,为新型工业纤维素酶以及其他工业酶的理性设计提供了理论基础。利用计算机辅助设计为突变体的理性设计提供了详细的结构基础。利用计算机模拟、结构能量合理性评估软件预测突变体结构功能变化影响,筛选出最合理的突变体,大大减少了实验和后期筛选的工作量。体现出生物技术与计算机技术的完美结合。

目录

文摘

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第一章绪论

1.1纤维素与纤维素酶

1.2纤维素酶的催化机制

1.3纤维素酶的结构

1.4纤维素酶的多型性

1.5纤维素酶的分类

1.6纤维素酶结构和功能的研究

1.7蛋白质工程与纤维素酶的人工进化

1.8目前面临的难题

1.9计算机辅助设计在新酶开发中的应用

1.8研究内容

1.8.1纤维素酶的家族同源分析及亚家族分类

1.8.2 EGV热稳定性突变体的理性设计

1.8.3 EGV突变体结构合理性评估和计算机模拟删选突变位点

第二章纤维素酶的家族5亚家族分类及其同源分析

2.1家族5的纤维素酶

2.2家族5纤维素酶亚家族分类

2.2.1家族5纤维素酶序列的收集

2.2.2酶的反应pH和温度收集

2.2.3进化树构建步骤

2.3亚家族5-A的纤维素酶

2.3.1 Bacillus.agaradhaerens Ce I5A(085465.1A3H)

2.3.2 Erwinia chrysanthemi Ce IZ(P071 03,1EGZ)

2.3.3 Bacillus.sp.strain KSM-635 Cellulase K(P19424，1G01)

2.4亚家族5-B的纤维素酶

2.5亚家族5-C的纤维素酶

2.6本章小结

2.6.1与pH适应性相关的因素

2.6.2与温度适应性相关的因素

第三章Humicola inslens EGV突变位点设计

3.1Humicola ins lens EGV简介

3.2诺维信公司对EGV耐酸碱性的改造

3.2.1诺维信催化域改造位点在一级序列和三维结构上的分布

3.2.2模拟突变体结构，分析cleft区域残基突变前后构象变化

3.3对EGV热稳定性的改造方案设计

3.3.1家族同源分析

3.3.2提高热稳定性的方法

3.3.3与耐热的maEG比较

3.3.4选择突变位点设计突变方案

3.4本章小结

第四章计算机筛选验证EGV突变点

4.1计算机分子模拟

4.2计算机筛选验证突变点

4.3独立的突变方案

4.3.1突变体三维结构预测

4.3.2立体化学合理性评估

4.3.3序列结构相容性评估

4.3.4原酶与突变体结构比对分析

4.3.5原酶与突变体二硫键变化分析

4.3.6原酶与突变体离子键变化分析

4.3.7原酶与突变体疏水性变化分析

4.3.8原酶与突变体溶剂可及性变化分析

4.3.9突变体的底物作用变化分析

4.3.10综合各项评价筛选突变方案

4.4组合的突变方案

4.4.1突变体三维结构预测

4.4.2立体化学合理性评估

4.4.3序列结构相容性评估

4.4.4原酶与突变体结构比对分析

4.4.5原酶与突变体二硫键变化分析

4.4.6原酶与突变体离子键变化分析

4.4.7原酶与突变体疏水性变化分析

4.4.8原酶与突变体溶剂可及性变化分析

4.4.9突变体的底物作用变化分析

4.4.10综合各项评价筛选突变方案

4.5本章小结

结论

参考文献

附录突变体的氨基酸序列和DNA序列

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢