镉螯合物特异性单克隆抗体的制备及其应用研究

摘要

镉是一种剧毒的重金属，在人体内的半衰期超过10年。镉通过各种食物链进入人体并高度积累，损害内脏器官，导致贫血、高血压、骨质疏松甚至癌症。由于环境的污染，许多食品中均有不同程度的镉残留存在。传统的检测方法包括石墨炉原子吸收光谱分析(GFAAS)与电感耦合等离子发射光谱分析(ICP—AES)等，这些方法费时费力，检测成本高，而利用镉螯合物单克隆抗体的酶联免疫吸附检测(ELISA)具有检测速度快、费用低廉、灵敏度高和选择性强等优点。 基于对农产品、食品与环境样品中镉残留的快速检测的需求，本论文利用人工合成的Cd—ITCBE—KLH免疫Balb/c小鼠，利用Cd—ITCBE—BSA、ITCBE—BSA检测效价和筛选，经过杂交瘤制备，阳性克隆筛选，制备了镉螯合物特异性单克隆抗体，建立检测Cd—EDTA的间接竞争ELISA与直接竞争ELISA，并用于检测不同样品中镉残留的含量。 制备了Cd—ITCBE—KLH与Cd—ITCBE—BSA，ITCBE—BSA，经超滤纯化后，利用二喹啉甲酸法(BCA)测三种抗原的浓度分别为5.68±0.12g/L、6.91±0.10g/L、4.56±0.10g/L，三硝基苯磺酸法(TNBSA)测三种抗原中ε—NH2被半抗原替换的程度依次为74.84±1.89％、82.42±2.05％、82.81±2.14％，GFAAS检测抗原中镉离子的含量依次为57.24±1.56mg/L、260.37±4.53mg/L、0mg/L，抗原与载体蛋白的紫外吸收光谱的特征各不相同，SDS—PAGE的结果显示三种抗原的分子量均高于各自的载体蛋白。 利用Cd—ITCBE—KLH免疫Balb/c小鼠，采用间接ELISA检测效价，三次免疫后，小鼠血清的效价最高可达6.40×10—5。取免疫后小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤，用Cd—ITCBE—BSA与ITCBE—BSA做包被抗原，筛选融合后能正常生长的细胞株，利用有限稀释法进行2次阳性克隆，筛选出三株细胞3A9D9A12、3A9D9G7、3A9D9H4，注入空白小鼠的腹腔，从制备的腹水中获取单克隆抗体。三株单抗的亚类为IgM，轻链为κ型，分子量约为900kDa，腹水的效价依次为1.00×10—4、4.00×10—4、2.00×10—4，识别Cd—ITCBE—BSA中镉螯合物的亲和常数分别为1.68×109、1.44×1010、5.33×109。利用HiTrapIgM亲和层析柱纯化镉螯合物单克隆抗体，收集洗脱峰，经超滤离心，三株IgM单克隆抗体的浓度依次为77.36±4.13mg/L、157.25±4.55mg/L、134.75±6.41mg/L，相应的得率为185.66±13.30mg/L、377.40±10.93mg/L、170.21±8.07mg/L腹水。选用亲和常数和灵敏度最高的mAb3A9D9G7株作进一步研究。 利用mAb3A9D9G7与Cd-ITCBE-BSA构建并优化间接竞争ELISA，Cd-ITCBE-BSA最佳浓度为4mg/L，mAb3A9D9G7的最佳浓度为40μg/L，EDTA的使用浓度为20mmol/L，最适pH值为7.4，检测下限为1.95μg/L，IC50为45.60μg/L，其它金属螯合物的交叉反应均低于0.90％，检测镉的样品回收率为97.67-107.08％，同一批次内与不同批次之间分析的变异系数分别为4.70％-9.21％和3.41-6.61％。利用该方法检测了自来水、电镀废水、灌木枝叶、小麦、大米、苹果汁、菠菜和茶叶等样品的镉含量，检测结果的变异系数为3.54-9.63％，与GFAAS的检测结果相比，二者的相关系数为0.9984。 利用mAb3A9D9G7构建并优化了直接竞争ELISA，mAb3A9D9G7的最佳浓度为62.50μg/L，酶标抗原Cd-ITCBE-HRP的最佳浓度为64μg/L，EDTA的使用浓度为8mmol/L，最适pH值为7.2，检测下限为0.10μg/L，IC50为3.01μg/L，其它金属螯合物的交叉反应均低于1.60％，检测镉的样品回收率为100.47-103.86％，同一批次内与不同批次之间分析的变异系数分别为3.63％-6.81％和1.73-7.14％。利用该方法检测了自来水、电镀废水、灌木枝叶、小麦、大米、苹果汁、菠菜、茶叶、濑尿虾和螺肉等样品的镉含量，检测结果的变异系数为1.01-8.51％，与GFAAS的检测结果相比，二者的相关系数为0.9992。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1镉的简介

1.1.1镉的理化性质

1.1.2镉的来源及分布

1.1.3镉的毒性作用机制

1.2单克隆抗体技术

1.2.1抗体技术概论

1.2.2杂交瘤制备

1.2.3抗体的应用

1.3镉检测技术

1.3.1传统方法

1.3.2镉免疫检测的研究现状

1.4本课题的研究背景、意义及研究内容

1.4.1研究背景和意义

1.4.2研究内容

1.4.3技术路线

第二章镉螯合物抗原的制备与鉴定

2.1前言

2.2实验材料

2.2.1主要仪器设备

2.2.2主要试剂

2.2.3溶液

2.3实验方法

2.3.1镉抗原的制备

2.3.2镉抗原的鉴定

2.4结果与讨论

2.4.1 BCA法测免疫原与包被抗原的浓度

2.4.2免疫原与包被抗原的紫外吸收光谱分析

2.4.3 TNBSA法测免疫原与包被抗原中的赖氨酸ε-氨基的替换程度

2.4.4 SDS-PAGE鉴定包被抗原与免疫原

2.4.5 GFAAS法测免疫原与包被抗原中镉离子的含量

2.5本章小结

第三章镉螯合物特异性单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

3.1前言

3.2实验材料

3.2.1实验动物与细胞株

3.2.2主要仪器设备与耗材

3.2.3主要试剂

3.2.4.培养基与常用溶液

3.3实验方法

3.3.1镉螯合物单克隆抗体的制备及纯化

3.3.2单克隆抗体的分析鉴定

3.4结果与讨论

3.4.1小鼠血清的效价分析

3.4.2细胞融合及阳性克隆筛选

3.4.3三株单克隆抗体类型的鉴定

3.4.4三株单克隆抗体的腹水效价检测

3.4.5三株单克隆抗体的纯化

3.4.6三株单克隆抗体的含量和纯度分析

3.4.7三株单克隆抗体亲和力的检测

3.4.8三株单克隆抗体识别Cd-EDTA特异性与灵敏度

3.5本章小结

第四章间接竞争ELISA的建立及其应用

4.1前言

4.2实验材料

4.2.1检测样品

4.2.2主要仪器设备

4.2.3主要试剂

4.2.4主要溶液

4.3实验方法

4.3.1 mAb3A9D9G7与Cd-ITCBE-BSA的最佳反应浓度

4.3.2 EDTA对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-BSA的影响

4.3.3 pH值对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-BSA的影响

4.3.4 Tris对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-BSA的影响

4.3.5间接竞争ELISA检测Cd-EDTA的标准曲线

4.3.6各种金属螯合物的交叉反应

4.3.7间接竞争ELISA检测镉离子浓度的准确性

4.3.8间接竞争ELISA检测镉离子浓度的重现性

4.3.9间接竞争ELISA的实际应用

4.4结果与讨论

4.4.1棋盘滴定法优化抗原与抗体的最佳反应浓度

4.4.2 EDTA对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-BSA的影响

4.4.3 pH值对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-BSA的影响

4.4.4 Tris对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-BSA的影响

4.4.5间接竞争ELISA标准曲线

4.4.6各种金属螯合物的交叉反应

4.4.7间接竞争ELISA检测镉离子浓度的准确性

4.4.8间接竞争EIJSA检测镉离子浓度的重现性

4.4.9间接竞争ELISA的实际应用

4.5本章小结

第五章直接竞争ELISA的建立及其应用

5.1前言

5.2实验材料

5.2.1检测样品

5.2.2主要仪器设备

5.2.3主要试剂

5.2.4主要溶液

5.3实验方法

5.3.1 Cd-ITCBE-HRP的合成与鉴定

5.3.2 mAb3A9D9G7与Cd-ITCBE-HRP的最佳反应浓度

5.3.3 EDTA对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-HRP的影响

5.3.4 pH值对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-HRP的影响

5.3.5 Tris对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-HRP的影响

5.3.6直接竞争ELISA检测Cd-ETDA的标准曲线

5.3.7各种金属螯合物的交叉反应

5.3.8直接竞争ELISA检测镉离子浓度的准确性

5.3.9直接竞争ELISA检测镉离子浓度的重现性

5.3.10直接竞争ELISA的实际应用

5.4结果与讨论

5.4.1 Cd-ITCBE-HRP的鉴定

5.4.2 mAb3A9D9G7与Cd-ITCBE-HRP的最佳反应浓度

5.4.3 EDTA对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-HRP的影响

5.4.4 pH值对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-HRP的影响

5.4.5 Tris对mAb3A9D9G7识别Cd-ITCBE-HRP的影响

5.4.6直接竞争ELISA检测镉螯合物的标准曲线

5.4.7各种金属螯合物的交叉反应

5.4.8直接竞争ELISA检测镉离子的准确度

5.4.9直接竞争ELISA检测镉离子的重现性

5.4.10直接竞争ELISA的实际应用

5.4本章小结

结论与展望

结论

本论文的创新之处

展望

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢