亮叶杨桐叶中黄酮类化合物的分离制备及生理活性研究

摘要

亮叶杨桐(Adinandra nitida)是一种主要分布于我国广西、广东、贵州等地的天然野生植物资源，以其鲜嫩叶制成的代茶—石崖茶(石芽茶)在华南民间有着悠久的饮用历史。石崖茶具有消炎解毒、降压、退热、止血、杀菌、镇痛等多种功能。目前在广西等地已有较大面积的亮叶杨桐的人工种植基地，但对其的开发利用仍然还仅限于初级茶叶加工。研究显示，亮叶杨桐叶中黄酮类化合物含量超过20％，主要包括山茶苷A、山茶苷B和芹菜素等，其中以山茶苷A的含量为最高。因此，从价廉易得的亮叶杨桐叶中制备高附加值的黄酮类化合物，可为深度开发和高效利用亮叶杨桐叶资源提供有益的参考，对于促进华南山区经济发展具有重要的现实意义。 采用高速逆流色谱法(HSCCC)对亮叶杨桐叶总黄酮提取物进行分离纯化。优化后的分离条件为，以乙酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5)为两相溶剂体系(其中上相为固定相，下相为流动相)，螺旋管转速900r/min，流动相流速2.0mL/min，温度25℃，检测波长280nm。以200mg样品溶于10mL下相溶剂进样，分离产物经真空浓缩、冷冻干燥，制备得到11.3mg山茶苷B和145.8mg山茶苷A。经HPLC-MS、UV、IR、NMR鉴定，该两种分离产物具有极高的纯度。 采用热提冷析的方法从亮叶杨桐叶中提取黄酮类物质，以响应面实验法对提取工艺条件进行优化，得到最佳提取工艺参数为：提取时间36min、液料比20、提取温度100℃。在该优化条件下，亮叶杨桐叶总黄酮的得率达到8.23％。其中，亮叶杨桐叶总黄酮提取物中山茶苷A的含量达到63.1％。 分别采用大孔吸附树脂法、水重结晶法和乙醇溶液重结晶法对山茶苷A进行纯化，并对其工艺进行优化。采用D101型大孔吸附树脂，以3.0mg/mL流速上样，以无水乙醇3.0mg/mL流速洗脱，最后经真空浓缩、干燥后，得到山茶苷A精制品的纯度达到91.7％，山茶苷A得率71.4％。以水重结晶5次后，山茶苷A纯度可达到97.8％，结晶产率为29.2％。以20％乙醇进行重结晶5次后，山茶苷A产品纯度达到98.2％，结晶产率32.8％。三种纯化方法中，采用20％乙醇重结晶法纯化山茶苷A的工艺具有操作简单、分离效率高、产品纯度高等优点，具有广阔的工业化应用前景。 采用不同方法(DPPH自由基清除试验、超氧阴离子清除试验、还原力测定以及亚油酸体系中抗氧化能力的测定)测定了山茶苷A、山茶苷B和芹菜素的抗氧化活性。结果显示，这三种黄酮类化合物均具有一定的抗氧化作用，并呈现出明显的剂量-效应关系。其中，山茶苷A和山茶苷B的抗氧化活性并无明显差异，但都明显强于芹菜素和染料木素。 采用MTT法对山茶苷A、山茶苷B和芹菜素的抗肿瘤活性进行了评价。结果显示，这三种黄酮类化合物对人表皮癌细胞A431和肺腺癌细胞A549都有良好的抑制作用，并呈现显著的时间-效应和剂量-效应关系。而且，三种物质对A431细胞的抑制作用，均明显其强于对A549细胞的抑制作用。其中，山茶苷A抑制肿瘤细胞的作用最强，其次是山茶苷B，芹菜素的作用最弱。 采用Rancimat法测定了15种天然黄酮类化合物在猪油体系中的抗氧化活性，并以量子化学方法计算其分子结构参数(包括△HOF、EHOMO、GAP、V、LogP、Dipole和NOH)，通过主成分回归法进行统计分析，对其抗氧化活性进行定量构效关系(QSAR)研究。从而建立了黄酮类化合物抗油脂氧化活性与其分子结构参数之间构效关系模型：LgPF=2.998262—0.007691×△HOF＋0.069501×EHOMO—0.249761×GAP—0.000269×V—0.130080×LogP—0.039331×Dipole＋0.192317×NOH。此模型可用于预测与本研究相同体系的黄酮类化合物的抗氧化活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1亮叶杨桐叶的研究概况

1.1.1亮叶杨桐叶的营养及活性成分研究

1.1.2亮叶杨桐叶生理功能的研究

1.2黄酮类化合物的研究概况

1.2.1黄酮类化合物的结构与分类

1.2.2黄酮类化合物的提取

1.2.3黄酮类化合物的分离纯化

1.2.4黄酮类化合物的生理功能

1.2.5黄酮类化合物的应用

1.3高速逆流色谱及其应用

1.3.1高速逆流色谱的原理

1.3.2高速逆流色谱设备

1.3.3高速逆流色谱的操作

1.3.4高速逆流色谱在植物活性成分提取分离中的应用

1.4量子化学方法在物质构效关系研究中的应用

1.4.1分子力学与量子化学

1.4.2量子化学在分子构效关系研究中的应用

1.5本论文的研究目的、意义及主要研究内容

1.5.1研究目的与意义

1.5.2主要研究内容

第二章 高速逆流色谱分离制备山茶苷A和B的研究

2.1实验材料

2.1.1原料

2.1.2主要试剂

2.1.3实验仪器

2.2实验方法

2.2.1高速逆流色谱分离试验

2.2.2分离产物的结构鉴定

2.3结果与讨论

2.3.1高速逆流色谱分离结果

2.3.2 HSCCC分离产物的结构鉴定

2.3.3山茶苷A和山茶苷B的外观形态

本章小结

第三章 亮叶杨桐叶中山茶苷A的提取制备

3.1实验材料

3.1.1原料

3.1.2主要试剂

3.1.3实验仪器

3.2实验方法

3.2.1亮叶杨桐叶总黄酮提取条件的优化

3.2.2总黄酮得率的计算

3.2.3山茶苷A含量的测定

3.3结果与讨论

3.3.1亮叶杨桐叶总黄酮及山茶苷A含量的测定

3.3.2.提取条件对亮叶杨桐叶总黄酮提取效果的影响

3.3.3亮叶杨桐叶总黄酮提取工艺的优化

本章小结

第四章 山茶苷A纯化方法的研究

4.1实验材料

4.1.1原料

4.1.2主要试剂

4.1.3实验仪器

4.2实验方法

4.2.1亮叶杨桐叶总黄酮提取物的制备

4.2.2大孔吸附树脂法纯化山茶苷A的研究

4.2.3重结晶法纯化山茶苷A的研究

4.2.4山茶苷A含量的测定

4.3结果与讨论

4.3.1大孔吸附树脂法纯化山茶苷A

4.3.2重结晶法纯化山茶苷A

4.3.3大孔吸附树脂法和重结晶法纯化山茶苷A效果的比较

本章小结

第五章 亮叶杨桐叶黄酮类物质生理功能的评价

5.1实验材料

5.1.1原料

5.1.2细胞株及培养基

5.1.3主要试剂

5.1.4实验仪器

5.2实验方法

5.2.1抗氧化活性的研究

5.2.2抗肿瘤活性的研究

5.3结果与讨论

5.3.1抗氧化活性

5.3.2抗肿瘤活性

本章小结

第六章 黄酮类化合物抗油脂氧化活性的构效关系研究

6.1实验材料

6.1.1原料

6.1.2主要试剂

6.1.3实验仪器

6.2实验方法

6.2.1 Rancimat测定抗氧化活性的原理及步骤

6.2.2分子结构参数的计算

6.2.3统计分析

6.3结果与讨论

6.3.1不同黄酮类化合物的抗油脂氧化能力

6.3.2黄酮类化合物分子的酚羟基对其抗氧化能力的影响

6.3.3分子结构参数、活性参数及其计算方法的选择

6.3.4黄酮类化合物在猪油体系中抗氧化活性构效关系的研究

本章小结

结论与展望

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢