高油脂含量小球藻株的筛选及油脂代谢调控的研究

摘要

小球藻（Chlorella sp.）是一类生长速度快，油脂含量较高的绿藻，并可通过优化培养条件大幅度提高其生物量和油脂含量。小球藻对碳源葡萄糖的代谢能力比其它微藻强，除了将其作为维持藻细胞生长和物质代谢的能量外，其余葡萄糖主要被转化为淀粉等其它碳水化合物、油脂类等物质贮存在藻细胞中。通常情况下，多糖类物质是小球藻储备葡萄糖的主要形式。通过调控小球藻的代谢途径可以改变碳源的主要代谢途径，从而有利于小球藻的油脂积累。为了开发小球藻作为生物柴油原料的非陆生作物来源，本论文研究高油脂含量小球藻株的快速筛选方法，调控小球藻C.vulgaris碳源代谢途径，利用两步法培养体系培养小球藻生产生物柴油。主要研究内容和结果如下：
　　 1.小球藻油脂含量快速测定法的建立及高油脂含量小球藻株的筛选
　　 通过建立快速、灵敏测定小球藻油脂含量的Nile red荧光分光光度法，快速检测出不同来源的七种小球藻中油脂含量。经实验验证，这些小球藻的油脂含量与所对应的相对荧光强度成很好的线性关系，表明通过Nile red荧光分光光度法能准确测定出小球藻藻株的油脂含量。实验还在同一培养条件下比较此七种小球藻的生物量，并结合C19脂肪酸内标法和GC-MS分析方法比较小球藻的总脂肪酸产量，最终确定油脂含量最高的小球藻株C.vulgaris（3＃）作为本论文的实验研究藻株。
　　 2.培养基组成对藻细胞生长及脂肪酸积累的影响
　　 葡萄糖是培养C.vulgaris的最佳碳源，葡萄糖浓度为80 g/L以下时藻细胞生长不会受到高浓度葡萄糖的抑制；初始浓度为30 g/L的葡萄糖在两周内基本消耗完毕。以甘氨酸为氮源时可得到最高细胞生长浓度；其次以硝酸钾为氮源；以尿素为氮源的培养基中得到的藻细胞总脂肪酸含量最高。综合考虑实验结果和成本问题，选择硝酸钾为氮源。研究还发现硝酸钾是小球藻生长的重要限制因子，培养C.vulgaris的最佳硝酸钾浓度为2.0 g/L。碳氮比为30.0/2.0（g/g）的培养条件下小球藻达到8.00 g/L的最大生物量，而总脂肪酸含量也可高达57.7％。高于30/1.2（g/g）的碳氮比也有利于脂肪酸的积累，但是生物量的产出有所降低。磷酸盐对小球藻生物量无太大的影响，总磷酸盐为15.0 mmol/L的磷酸盐体系得到的总脂肪含量最高。Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+对小球藻生物量和总脂肪酸含量有一定影响；Mn2+、Mo5+对生物量有一定影响而对总脂肪酸含量无明显的影响；Fe3+对藻生物量和总脂肪酸含量都无太大影响，说明Fe3+对藻生长没有特别的贡献。
　　 3.藻培育环境条件对细胞生长及脂肪酸合成的影响
　　 小球藻C.vulgaris的最适生长温度为23℃，低于20℃下的小球藻生长相对缓慢，而在26℃以上温度下小球藻的生长受到明显的抑制，在34℃以上高温下基本无生长迹象。pH为6.0～8.0是小球藻生长的最适条件，而低pH有利于藻脂肪酸的积累，综合考虑小球藻的生物量和总脂肪酸含量，培养基初始pH值定为6.0。有利于小球藻生物量提高的光照强度为1000Lx～4000Lx；有利于脂肪酸的积累的光照强度为5000Lx～7000Lx。添加NaCl不利于小球藻生物量的提高，但在一定程度上可提高藻脂肪酸含量。
　　 4.小球藻C.vulgaris的碳源代谢调控及通量分析
　　 小球藻是一类葡萄糖代谢能力很强的微藻，而小球藻储备碳源的主要形式是碳水化合物和脂类，改变光照强度可以调控藻内代谢物的合成途径。低光照强度（4000Lx）可以激发藻内相关酶的活性，加快对培养基中碳、氮的吸收，使代谢途径的葡萄糖代谢通量比无光照条件下提高1.56倍。代谢通量分析结果表明：在低光照强度条件下，由于大部分碳流被分配到碳水化合物类物质的合成中，所以分流到糖酵解途径的碳流比无光照条件下糖酵解途径中的碳流有所减少，但是光照条件下生成的一部分GAP增加了碳酵解途径中的碳流量，合成生物量的通量增加了1.56倍，而合成脂肪酸的通量比无光照条件下只增加1.9％。所以低光照强度更有利于多糖类物质和藻生物量的提高。
　　 5.培养基的组成和培养控制条件的优化
　　 采用正交试验优化培养基的组成和培养条件。极差和方差分析结果表明有利于小球藻生物量提高的因素主要有：葡萄糖，NaCl，硫酸锌，硫酸铜，溶液pH值，其最佳因子组成为：葡萄糖：20 g/L，KNO3：2.0g/L，总磷酸盐：20.0 m mol/L，MgSO4·7H2O：1.5 g/L，FeSO4·7H2O：60 mg/L，ZnSO4·7H2O：0.6 mg/L，CuSO4·5H2O：0.2 mg/L，CaCl2·2H2O：50 mg/L，pH：6.0，NaCl：0 mol/L。有利于总脂肪酸含量提高的因素主要有：葡萄糖，溶液pH值，其最佳因子组成为：葡萄糖：20 g/L，KNO3：1.0 g/L，总磷酸盐：10.0mmol/L，MgSO4·7H2O：1.5 g/L，FeSO4·7H2O：40mg/L，ZnSO4·7H2O：0.2mg/L，CuSO4·5H2O：0.1mg/L，CaCl2·2H2O：50mg/L，pH：6.0，NaCl：0mol/L。
　　 6.利用两步培养体系培养小球藻C.vulgaris生产生物柴油
　　 结合小球藻代谢调控分析结果，采用两步培养法提高藻生物量和总脂肪酸产量，其生物量能达到14.22 g/L，总脂肪酸产量达到11.63 g/L，其生物量比两种单步培养条件下培养基Ⅰ和培养基Ⅱ下生长的小球藻生物量分别提高1.72和2.19倍；总脂肪酸产量分别提高2.53和2.24倍。总脂肪酸含量和热焓值（26.870 MJ/kg）接近于油脂优化培养体系中小球藻的总脂肪酸含量和热焓值。表明两步培养法体系中的小球藻既满足了高密度生长的需求也有利于脂肪酸的生成。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：文中重要物质代号索引

声明

第一章 绪论

1.1 可再生能源

1.1.1. 可再生能源概述

1.1.2. 生物质能源的来源

1.1.3. 生物质能源的开发和利用

1.1.4. 生物柴油的开发利用及应用前景

1.2 微藻作为可再生能源的利用

1.2.1. 微藻中的脂类物质

1.2.2. 热解技术在微藻能源开发中的应用

1.2.3. 微藻技术制备可燃性气体

1.2.4. 微藻技术制备生物柴油

1.3 微藻培养技术研究进展

1.3.1 微藻的营养方式

1.3.2 微藻的培养体系

1.4 藻细胞生长及藻内油脂合成的影响因素

1.4.1 培养基组分的影响

1.4.2 培养条件的影响

1.5 代谢工程在微藻生物技术中的应用

1.6 选题依据和主要研究内容

1.6.1 立题背景

1.6.2 研究意义

1.6.3 主要研究内容

第二章 高油脂含量小球藻藻株筛选方法的建立

2.1 材料和试剂

2.1.1 实验藻株

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂

2.1.4 仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 藻株培养条件

2.2.2 藻细胞的干重测定

2.2.3 油脂测定方法

2.2.4 荧光显微镜下染色藻细胞的荧光特性

2.3 结果与讨论

2.3.1 荧光分光光度法优化体系的建立

2.3.2 Leica DMR XP荧光显微镜观察优化体系下的小球藻荧光特性

2.3.3 油脂重量测定法和荧光分光光度法测定七种小球藻内油脂含量的相关性

2.3.4 小球藻的油脂含量和生物量结果比较

2.4 小结

第三章 培养基组成对藻细胞生长及脂肪酸合成的影响

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料与试剂

3.1.2 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 小球藻(C.vulgaris)的培养

3.2.2 藻细胞的生长及生物量的测定

3.2.3 藻细胞油脂含量的测定

3.2.4 培养液葡萄糖浓度的测定

3.2.5 培养液NO3-浓度的测定

3.2.6 总脂肪酸含量及产量的测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 小球藻(C.vulgaris)内脂肪酸成分的鉴定

3.3.2 各脂肪酸标样与Methyl nonadecanoate(C20H40O2)标样的相对校正因子计算

3.3.3 碳源

3.3.4 氮源

3.3.5 磷酸盐

3.3.6 金属离子

3.4 本章小结

第四章 环境条件对细胞生长及脂肪酸合成的影响

4.1 材料与方法

4.1.1. 材料

4.1.2. 方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 温度

4.2.2 pH

4.2.3 光照

4.2.4 盐度

4.3 本章小结

第五章 小球藻(C.vulgaris)代谢调控分析

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 仪器和试剂

5.1.3 培养基和培养方法

5.1.4 样品的分析方法

5.2 小球藻(C.vulgaris)培养过程中脂肪酸代谢调控分析

5.2.1 实验结果

5.2.2 小球藻(C.vulgaris)的脂肪酸代谢模型

5.2.3 小球藻(C.vulgaris)的代谢通量分析

5.3 本章小结

第六章 高油脂产量藻C.vulgaris培养条件的优化及其两步法培养

6.1 材料和仪器

6.1.1 材料

6.1.2 仪器

6.2 正交实验因子和因子水平的确定

6.3 实验方法

6.4 实验数据的极差分析

6.4.1 生物量的极差分析

6.4.2 总脂肪酸含量的极差分析

6.5 实验数据的方差分析

6.5.1 生物量的方差分析

6.5.2 总脂肪酸含量的方差分析

6.6 葡萄糖和硝酸钾的转化率及利用率

6.7 两步培养法的依据

6.8 实验条件和方法

6.9 实验结果

6.9.1 单步培养法

6.9.2 两步培养法

6.10 本章小结

结论与展望

一、结论

二、创新点

三、展望

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢