醋酸杆菌细胞催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原反应的研究

摘要

本论文从中华开菲尔菌粒中筛选到一株能高效、高选择性、遵循反Prelog规则催化TMSE不对称还原生成对映体纯(R)-TMSOL的醋酸杆菌，并且对比研究不同介质中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原成(R)-TMSOL的反应过程，探讨离子液对该反应的影响规律，揭示含离子液介质中醋酸杆菌细胞的催化特性，并以此为基础，建立起可用于高效、高选择性合成对映体纯(R)-TMSOL的生物催化反应体系。
　　 从中华开菲尔菌粒中分离得到三株菌：XZY001、XZY003、XZY004。通过形态学和生理生化的初步鉴定，菌株XZYOOI属于乳酸菌中的乳杆菌属短乳杆菌种；菌株XZY004属于酵母菌中的毕赤酵母属；菌株XZY003属于醋酸菌中的醋酸杆菌属。其中，菌株XZY003催化TMSE不对称还原为(R)-TMSOL的效果最好，进一步的16S rRNA基因序列分析表明，其属于醋酸杆菌属亚种，命名为Acetobacter sp. CCTCC M209061。
　　 在供试的微生物菌种中，醋酸杆菌细胞能高效催化TMSE不对称还原生成(R)-TMSOL。在水相反应体系中，醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的最适pH值、辅底物、辅底物浓度、反应温度、底物浓度和振荡速度分别是5.0、异丙醇、130.6mmol/L、30℃、6.0 mmol/L和180 r/min；在此最适条件下，反应的初速度、最大产率及产物的e.e.值分别为0.50μmol/min、71％和99％以上。显然，最大产率和最适底物浓度较低，这可归因于水相中存在较为严重的底物和产物抑制、底物分解和逆反应。
　　 为了进一步提高反应底物浓度和反应效率，本研究尝试采用相转移的方法，以期利用第二相对底物和产物的萃取作用，降低水相中底物和产物的浓度，从而减轻底物和产物抑制、底物分解和逆反应。有机溶剂/缓冲液是常见的双相反应体系，为此，首先在不同有机溶剂与缓冲液组成的双相体系中进行醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应。发现不同有机溶剂对该反应的影响各异。在所研究的有机溶剂中，疏水性较强的正己烷为最适有机相。在正己烷/缓冲液双相反应体系中，该反应的最适两相体积比、底物浓度、缓冲液pH值、反应温度和振荡速度分别为1/2(缓冲液/正已烷)、9.0 mmol/L、5.0、30℃和180 r/min；在上述最佳反应条件下，反应初速度、最大产率和产物e，e.值分别为1.82μmol/h、90％和>99％。与水相反应体系相比，正己烷/缓冲液双相反应体系有效地解决了底物的分解等问题，显著提高了该反应的最适底物浓度和最大产率。然有机溶剂对细胞有一定的毒性作用，导致该反应速度较慢。
　　 为解决上述问题，本文采用具有良好生物相容性的疏水性离子液替代有机溶剂。在所研究的疏水性离子液中，C4MIM-PF6为该反应的最适第二相。在C4MIM-PF6/缓冲液双相反应体系中，醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的最适两相体积比、底物浓度、缓冲液pH值、辅底物浓度、反应温度和振荡速度分别为4/1(缓冲液/C4MIM·PF6)、36.0 mmol/L、5.0、555.7 mmol/L、30℃和200 r/min；在上述最佳反应条件下，反应初速度、最大产率和产物e.e.值分别为9.5/nnol/h、95％和>99％。显然，C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系能大大提高该反应的最适底物浓度、反应初速度及最大产率。
　　 相比于水相反应体系和正已烷/缓冲液反应体系，醋酸杆菌细胞在含离子液的反应体系中具有较好的操作稳定性，在所研究的三种反应体系中，醋酸杆菌细胞在C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系中具有最好的操作稳定性，在含有机溶剂的双相反应体系中其操作稳定性最差，这可能是由于离子液较有机溶剂具有较低的细胞毒性。
　　 文中首次利用可望取得自主知识产权的醋酸杆菌Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞为生物催化剂，其在含离子液介质中能高效、高选择性、遵循反Prelog规则催化TMSE不对称还原生成对映体纯的(R)-TMSOL，该反应的最大产率及产物的对映体选择性均远高于现有报道的对应值。本研究不仅有助于丰富对含离子液介质中生物催化的认识，还提供了一条高效制备对映体纯手性有机硅醇的新途径。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 手性中间体和手性药物

1.1.1 手性药物的生物活性类型

1.1.2 手性化合物的制备

1.1.3 手性中间体和手性药物的发展与趋势

1.2 有机硅化合物的重要性及其合成

1.3 用于手性醇制备的生物催化剂

1.4 含离子液介质中的生物催化

1.4.1 离子液的定义

1.4.2 离子液的种类

1.4.3 离子液的理化性质

1.4.4 离子液的突出优点

1.4.5 离子液中的生物催化与生物转化

1.4.6 离子液作为生物催化反应介质所面临的挑战

1.5 本研究的主要内容和意义

第二章 水相中醋酸杆菌细胞催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原反应的研究

2.1 实验材料

2.1.1 微生物菌种

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂

2.2 主要仪器设备

2.3 实验方法

2.3.1 筛选方法

2.3.2 酵母菌的鉴定

2.3.3 乳酸菌的鉴定

2.3.4 醋酸菌的鉴定

2.3.5 醋酸杆菌细胞冻干粉的制备

2.3.6 气相色谱(GC)分析

2.3.7 反应初速度、最大产率和产物对映体纯度的确定

2.3.8 菌种的筛选

2.3.9 缓冲液pH值对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.10 不同辅底物对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.11 辅底物浓度对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.12 底物浓度对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.13 反应温度对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.14 振荡速度对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.15 添加产物对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4 结果与讨论

2.4.1 微生物菌株分离、纯化与复筛

2.4.2 微生物菌株的鉴定

2.4.3 醋酸杆菌Acetobacter sp.CCTCCM209061和其它微生物细胞催化TMSE不对称还原反应的比较

2.4.4 缓冲液pH值对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.5 不同辅底物对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.6 辅底物浓度对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.7 底物浓度对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.8 反应温度对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.9 振荡速度对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.10 添加的产物浓度对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.5 本章小节

第三章 有机溶剂/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原反应的研究

3.1 实验材料

3.1.1 微生物菌种

3.1.2 主要试剂

3.2 主要仪器设备

3.3 实验方法

3.3.1 醋酸杆菌细胞对有机溶剂的耐受性

3.3.2 醋酸杆菌细胞的培养

3.3.3 醋酸杆菌细胞冻干粉的制备

3.3.4 气相色谱(GC)分析

3.3.5 反应初速度、最大产率和产物对映体纯度的确定

3.3.6 不同有机溶剂对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.7 TMSE和TWSOL在有机溶剂/缓冲液两相中的分配

3.3.8 两相体积比对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.9 底物浓度对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.10 缓冲液pH对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.11 反应温度对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.12 振荡速度对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4 结果与讨论

3.4.1 不同有机溶剂对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.2 两相体积比对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.3 底物浓度对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.4 缓冲液pH对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.5 反应温度对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.6 振荡速度对正己烷/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.5 本章小结

第四章 含离子液介质中醋酸杆菌细胞催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原反应的研究

4.1 实验材料

4.1.1 微生物菌种

4.1.2 主要试剂

4.2 主要仪器设备

4.3 实验方法

4.3.1 醋酸杆菌细胞对离子液的耐受性

4.3.2 醋酸杆菌细胞的培养

4.3.3 醋酸杆菌细胞冻干粉的制备

4.3.4 气相色谱(GC)分析

4.3.5 反应初速度、最大产率和产物对映体纯度的确定

4.3.6 不同疏水性离子液对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.3.7 TMSE和TMSOL在离子液/缓冲液两相中的分配

4.3.8 两相体积比对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.3.9 缓冲液pH值对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.3.10 底物浓度对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.3.11 辅底物浓度对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.3.12 反应温度对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.3.13 振荡速度对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.3.14 不同反应介质中醋酸杆菌细胞的操作稳定性

4.4 结果与讨论

4.4.1 不同疏水性离子液对醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.4.2 两相体积比对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.4.3 缓冲液pH值对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.4.4 底物浓度对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.4.5 辅底物浓度对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.4.6 反应温度对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.4.7 振荡速度对C4MIM·PF6/缓冲液双相体系中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

4.4.8 醋酸杆菌细胞在不同反应介质中的操作稳定性

4.5 本章小节

结论与展望

参考文献

附录 GC色谱图

攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢