固定化酵母细胞催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原反应的研究

摘要

有机硅化合物是一类含C-Si键的非天然化合物,其不仅在不对称合成及功能材料中有非常重要的作用,而且许多有机硅化合物还具有特殊的生物学活性,其作为药物,较其碳结构类似物具有更强的药效、更高的选择性和更低的毒性。“硅替代”是药物设计、改造的有效途径。对映体纯的4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇(TMSOL)是一种重要的药物手性中间体,可用于合成5'-脂氧化酶抑制剂,来治疗风湿性关节炎,哮喘等疾病,化学法合成手性硅醇的条件甚为苛刻,而且需要使用昂贵的手性试剂才能确保物质的手性纯度,而生物合成法因具有高效性、高对映体选择性、反应条件温和及环境污染小等优点而日益受到有机化学家的青睐。因此生物合成对映体纯的TMSOL具有重要的意义。此外,近年来,离子液体作为绿色反应介质应用于生物催化与生物转化已引起了人们广泛的关注。研究结果表明,许多酶以及微生物细胞在含离子液体介质中具有较高的活性、选择性及稳定性,含离子液体介质中的生物催化反应具有广阔的应用前景。基于以上情况,本论文对比研究了不同介质中酵母细胞催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮(TMSE)不对称还原反应过程,探讨离子液体对反应的影响规律,揭示含离子液体介质中生物催化特性,并以此为基础,创立具有自主知识产权的可用于高效制备对映体纯(S)-TMSOL的生物催化体系。 底物TMSE在pH大于6的水相体系中很不稳定,极易分解为羰基炔烃和三甲基羟基硅烷。然而降低缓冲液的pH值能使底物相对比较稳定。在供试的14株微生物菌种中,近平滑假丝酵母能高效催化TMSE不对称还原生成(S)-TMSOL。在水相体系中,最适pH值、辅底物浓度、反应温度、底物浓度和振荡速度分别是5.0、65.3 mmol/L、30℃、3.0 mmol/L和160 r/min;在此最适条件下,反应的初速度、最大产率及产物的e.e.值分别为14.8 μmol/h、81.3％和99.9％以上。 在正庚烷/缓冲液双相反应体系中,反应的最适两相体积比、底物浓度、缓冲液pH值、辅底物浓度、反应温度和振荡速度分别为2/1(缓冲液/正庚烷)、12.0 mmol/L、5.0、130.6 mmol/L、30℃和180 r/min;在上述最佳反应条件下,反应初速度、最大产率和产物e.e.值分别为3.8 μmol/h、75.6％和>99.9％。采用正庚烷/缓冲液双相体系,可以提高底物在反应体系中的稳定性,有效地解决底物的分解问题。然而,反应的最大产率低于水相中的对应值(81.3％)。 采用C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系,能有效地抑制底物的分解,而且该离子液双相体系具有很好的生物相容性。在C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系中,固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的最适两相体积比、底物浓度、缓冲液pH值、辅底物浓度、反应温度和振荡速度分别为4/1(缓冲液/C4MIM·PF6)、18.0 mmol/L、5.0、393.0 mmol/L、30℃和200 r/min;在上述最佳反应条件下,反应初速度、最大产率和产物e.e.值分别为5.6 μmol/h、87.8％和>99.9％。亲水性离子液体的种类对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的初速度、最大产率和产物e.e.值都有重要的影响。在反应体系中加入离子液体C2OHMIM·NO3,能在一定程度上抑制底物的分解,提高反应的最大产率。在C2OHMIM·NO3-缓冲液混合反应体系中,反应的最适离子液浓度、底物浓度、缓冲液pH值、辅底物浓度、反应温度和振荡速度分别为10％(v/v)、3.0 mmol/L、5.0、98.1 mmol/L、30℃和180 r/min;在上述最佳反应条件下,反应初速度、最大产率和产物e.e.值分别为13.8 μmol/h、95.2％和>99.9％。 相比于水相反应体系和正庚烷/缓冲液反应体系,固定化近平滑假丝酵母细胞在含离子液体的反应体系中具有较好的操作稳定性,在所研究的四个反应介质中,酵母细胞在C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系中具有最好的操作稳定性,在含有机溶剂的双相反应体系中其操作稳定性最差,这可能是由于离子液体相比于有机溶剂具有较低的细胞毒性所导致的。另外,离子液体与固定化载体海藻酸钙之间的相互作用可能有助于维持其稳定性。 文中首次采用固定化微生物细胞成功进行催化TMSE不对称还原生成对映体纯(S)-TMSOL的反应,反应的最大产率及产物的对映体选择性均远高于现有报道的对应值。本研究不仅有助于丰富对含离子液体介质中生物合成与生物转化的认识,还提供了一条制备对映体纯手性硅醇的行之有效的新途径。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1含离子液体介质中的生物催化

1.1.1离子液体的定义

1.1.2离子液体的种类

1.1.3离子液体的理化性质

1.1.4离子液体的突出优点

1.1.5离子液体中的生物催化与生物转化

1.1.6离子液体作为生物催化反应介质所面临的挑战

1.2手性中间体和手性药物

1.2.1手性药物的生物活性类型

1.2.2手性化合物的制备

1.2.3手性中间体和手性药物的发展与趋势

1.3有机硅化合物的重要性及其合成

1.4用于手性药物制备的生物催化剂

1.5本研究的主要内容和意义

第二章水相反应体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化4.三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原反应的研究

2.1实验材料

2.1.1微生物菌种

2.1.2主要试剂

2.2主要仪器设备

2.3实验方法

2.3.1微生物的培养

2.3.2微生物细胞的固定化

2.3.3气相色谱(GC)分析

2.3.4气相色谱-质谱(GCMS)联用分析

2.3.5反应初速度、最大产率和产物对映体纯度的确定

2.3.6菌种的筛选

2.3.7缓冲液的pH值对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.8辅底物浓度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.9反应温度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.10底物浓度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.11添加的产物浓度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.3.12振荡速度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4结果与讨论

2.4.1不同菌种催化TMSE不对称还原反应的研究

2.4.2缓冲液的pH值对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.3辅底物浓度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.4反应温度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.5底物浓度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.6添加的产物浓度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.4.7振荡速度对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

2.5本章小结

第三章含有机溶剂介质中固定化近平滑假丝酵母细胞催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原反应的研究

3.1实验材料

3.1.1微生物菌种

3.1.2主要试剂

3.2主要仪器设备

3.3实验方法

3.3.1吕氏美蓝染色液的配制

3.3.2近平滑假丝酵母细胞的培养

3.3.3近平滑假丝酵母细胞的固定化

3.3.4气相色谱(GC)分析

3.3.5反应初速度、最大产率和产物对映体纯度的确定

3.3.6不同有机溶剂对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.7两相体积比对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.8底物浓度对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.9缓冲液pH对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.10辅底物浓度对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.11反应温度对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.3.12振荡速度对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4结果与讨论

3.4.1不同有机溶剂对固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.2两相体积比对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.3底物浓度对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.4缓冲液pH对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.5辅底物浓度对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.6反应温度对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.4.7振荡速度对正庚烷／缓冲液双相体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的影响

3.5本章小结

第四章含离子液体介质中固定化近平滑假丝酵母细胞催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原反应的研究

4.1实验材料

4.1.1微生物菌种

4.1.2主要试剂

4.2主要仪器设备

4.3实验方法

4.3.1吕氏美蓝染色液的配制

4.3.2近平滑假丝酵母细胞的培养

4.3.3近平滑假丝酵母细胞的固定化

4.3.4气相色谱(GC)分析

4.3.5反应初速度、最大产率和产物对映体纯度的确定

4.3.6含离子液体双相反应体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的研究

4.3.7含离子液体单相反应体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的研究

4.3.8固定化近平滑假丝酵母细胞在不同反应介质中的操作稳定性

4.4结果与讨论

4.4.1含离子液体双相反应体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的研究

4.4.2含离子液体单相反应体系中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的研究

4.4.3固定化近平滑假丝酵母细胞在不同反应介质中的操作稳定性

4.4.4在不同反应介质中固定化近平滑假丝酵母细胞催化TMSE不对称还原反应的结果比较

4.5本章小结

结论与展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢