中医五脏相关理论探讨及补脾益肾法对大鼠MSCs增殖和分化的影响

摘要

研究目的： 对五脏相关理论进行梳理和探讨，在此基础上，对子系统“脾肾相关”理论进行更为深入的研究，提出“骨髓间充质干细胞(MSCs)为脾肾相关细胞层次表达的存在形式”的工作假说，探讨补脾益肾法对大鼠MSCs增殖和分化的影响，从微观角度和干细胞水平研究脾肾相关。 研究方法： 一、五脏相关理论探讨 (一)五脏相关学说的缘起： 1.五脏相关源流探讨：经考证，词义最接近、年代最早的文献是《素问.玉机真脏论》：“五脏相通，移皆有次”。古人通过阐述五脏功能互用和脏腑相合相通理论、气机升降出入、疾病的传变、五脏旁通之说、天人相应及药性归经理论体现五脏之气相通。 2.中医五脏相关学说的形成与发展：邓铁涛教授在几十年的临床实践中，把五行学说和脏腑学说结合起来，提出了“五脏相关”学说。 (1)理论研究继续深化：90年代末本世纪初，邓铁涛教授指导两位博士研究生赵氏、郑氏对五脏相关学说科学内涵进行探讨。认为五脏相关学说是对中医经典理论五行学说的继承和发展，具有跨学科的特点。. (2)五脏相关学说临床研究：五脏相关临床研究是目前研究的重点，主要有两个层次的研究，一是五脏相关总体层面的研究，二是深入到子系统如两脏相关的研究。面上的研究显示五脏相关理论已经广泛应用于临床各个系统疾病的治疗，与此同时，各个子系统的研究也逐渐开展。目前，以两两相关的研究较多。如脾(胃)肾相关，心脾(胃)相关，肝脾(胃)相关，胆胃相关，肺脾(胃)相关，心肺相关，心胆相关，心肾相关，肺肾相关，肝肾相关，肝肺相关等。 (3)五脏相关学说实验研究：部分学者进行了实验研究，揭示了五脏中的肝、脾(这里指空肠绒毛)、肾之间的相生、相克关系，“肺肾相关”的物质基础，中医“心肾相关”理论的科学内涵等。 (二)脾肾相关子系统研究： 中医脾肾相关子系统以阐发脾和肾相关的生理功能、病理变化机理及其证治方药为中心内容，体现了脏腑同病病机和整体观念。与传统的中医理论比较，脾肾相关吸取了五行学说中“土制水”的精神内核，并综合了历代医家对脾肾相互关系的不断发展，而将二者之间动态的、错综复杂的相互关系用“相关”来概括。近年来，国内有关脾肾相关的实验研究报道陆续出现，多从神经递质、激素、内分泌、细胞因子水平进行研究。 二、补脾益肾法对大鼠MSCs增殖和分化的影响： 1.MSCs的分离和培养 取4周龄SPF级SD大鼠4只，无菌条件下取双股骨及胫骨，收集骨髓腔内组织细胞，密度梯度离心，收取单核细胞层，加入IMDM培养液。计数板计数，按1×104个/瓶密度接种于75cm2培养瓶中，置于37℃，5％饱和湿度的CO2培养箱中培养，2d后半量更换培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3d换液一次，观察细胞形态、贴壁及生长情况。细胞培养7-10天后细胞密度较高，达90％融合后，胰蛋白酶消化，常规传代。 2.双标免疫组化检测： 传三代后的细胞种入在装有IMDM空白培养基的24孔板中，24小时后固定；经3％H2O2消化内源性酶，正常山羊血清封闭，一抗用多克隆兔抗(CD44、CD54)，二抗用生物素化羊抗兔，BCTP/NBT显色。双标阻断液阻断后，正常山羊血清封闭，一抗用Brdu(小鼠单克隆抗体)，二抗用生物素化羊抗小鼠IgG，加SABC，最后用DAB显色。 3.MTT法细胞活性检测： 制备单细胞悬液，计数，接种于96孔板，1×103个细胞/孔，分别加入相应剂量的血清或药物。各组同时培养达72h后每孔加入MTT，继续孵育4h，每孔吸去50μl培养液。然后每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，用酶标仪测光吸收值(OD)，绘制增殖曲线。所得数据用SPSS11.5软件进行统计，实验结果用均数±标准差((x)±s)表示，用t检验和单因素方差分析确定差异显著性。并绘制均数图。 4.诱导分化： MSCs传至第3代时，按1.0×103个细胞/孔，接种于24孔培养板中，以完全培养基培养；接种24小时后，去除非贴壁细胞，分别改用诱导培养基继续培养3d、7d、14d，空白血清对照在上述诱导培养基中改含药血清为空白血清100μ()，空白对照仅加入IMDM空白培养基1ml。 5.免疫细胞组化分析 诱导分化3、7、14天后终止培养，多聚甲醛固定，过氧化氢封闭，滴加羊血清，加入一抗工作液(myosin、desmin)，生物素标记羊抗小鼠IgG，DBA显色，或加用苏木素复染，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，试验对照用未诱导的细胞爬片进行染色。观察诱导后细胞肌分化相关蛋白(myosin、desmin)表达的观察，并与阴性对照组及试验对照组进行比较。 研究结果： 一、五脏相关理论研究： 五脏相关的研究已经从文献、临床和实验等多个方向全面铺开，理论初具框架，内容也很丰富，已经从面上的研究深入到各个子系统。脾肾相关作为研究基础较好，研究模式较完备的子系统之一，在指导痿证(包括运动神经元疾病、重症肌无力，肌营养不良等肌肉疾病及骨质疏松症)治疗中取得了突出疗效，课题组已经进行了大量的文献整理、理论探讨及临床研究工作，近年来，国内有关脾肾相关的实验研究报道陆续出现，多从神经递质、激素、内分泌、细胞因子水平进行研究，目前，尚未有从干细胞水平进行脾肾相关的实验研究。 二、补脾益肾法对大鼠MSC增殖和分化的影响： 1.MSCs的分离、培养与鉴定： 原代培养，细胞呈圆形，24小时后，部分细胞贴壁，贴壁细胞中有部分细胞体积增大，变形。培养2天后可见瓶内散在分布有单个或多个梭形细胞，原代培养至4-6天，细胞缓慢形成由几个或10-20个细胞组成的细胞克隆，7-9天左右细胞不断增殖，局部区域逐步连接成片，当细胞能达到80％以上融合成片，即可进行消化和传代。免疫细胞双标化学染色结果显示，所培养的细胞同时表达Brdu和CD44、CD45，表达率达96％以上，表明所培养的是具有分裂和增殖能力的MSCs。 2.各用药组对MSCs的增殖作用： 强肌健力口服液低、中、高剂量三组在达一定浓度时(5％-10％)均可以促使MSCs增殖，与浓度呈正比，呈明显量效依赖关系，表明低剂量组(生理剂量)的强肌健力口服液含药血清即可以对MSCs的增殖产生明显的作用。龟板含药血清低剂量组对MSCs的体外增殖作用与浓度呈正比，呈明显量效依赖关系。除龟高10μ(l)加强高10μ(l)、龟高15μ(l)加强高5μ(l)两个剂量组外，其余强肌健力口服液与龟板混合血清用药组各组均对MSCs有显著的增殖作用，除龟高10μ(l)加强低10μ(l)剂量组外，其他与强肌健力口服液含药血清低、中、高剂量20μ(l)、龟板低剂量含药血清20μ(l)比较，均有显著性差异，表明二者合用对MSCs具有更好的增殖作用。 3.各用药组对MSCs分化的影响： 诱导3天后，强肌健力口服液低剂量组、强肌健力口服液与龟板混合组部分细胞出现阳性反应，且其阳性率与剂量无明显的相关性，未经诱导分化的及空白血清诱导的骨髓间质干细胞的胞浆不染色，提示诱导分化后的细胞有肌细胞特性。强肌健力口服液重复实验见用药各剂量组均有部分细胞出现弱阳性反应，空白对照为阴性反应。诱导后3天，5-氮杂胞苷组部分细胞出现desmin阳性表达，诱导后14d，部分细胞表达myosin，未经诱导的细胞其myosin及desmin表达均呈阴性。阳性细胞主要见于5-Aza10μmol/l浓度组，其中5-Aza15μmol/l组细胞培养三天后大部分死亡。 结论： 1.邓铁涛教授提出的“五脏相关”学说，是当代中医学术发展的理论组成部分之一，长期以来对中医临床各科有着广泛的指导作用。中医脾肾相关是“五脏相关”子系统之一，实验研究是其薄弱环节，未有从干细胞水平进行的研究。 2.实验所培养的为有增殖能力的MSCs，生理剂量的强肌健力口服液含药血清即可以对MSCs的增殖产生明显的作用，且呈明显量效依赖关系。.一定比例配比的强肌健力口服液与龟板混合血清对MSCs的增殖作用较单纯的强肌健力口服液含药血清或龟板含药血清强，强肌健力口服液补脾，龟板补肾，说明脾肾并补较之单纯补脾或者补肾更能促进MSCs的生长。 3.强肌健力口服液含药血清及其与龟板混合血清诱导MSCs分化及5-Aza诱导MSCs分化，经desmin、myosin抗体染色均有部分细胞出现阳性反应，表明补脾法或补脾兼以补肾法可以促使骨髓间充质干细胞向成肌方向转化；5-Aza也可以促使骨髓间充质干细胞向成肌方向转化。

目录

文摘

英文文摘

广州中医药大学学位论文原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

引言

第一部分：五脏相关理论研究

第二部分：补脾益肾法对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

结语

参考文献

附篇：脾肾相关理论指导重症肌无力危象抢救医案举隅

研究生在学期间发表论文情况

致谢