葛根素对脑缺血再灌注损伤大鼠海马CA1区锥体细胞L-型钙通道的影响

摘要

葛根素对脑缺血再灌注损伤大鼠海马CA1区L-型钙通道的影响葛根素(Puerarin)是临床上常用的中药注射剂。作为改善心脑血管循环的药物，广泛运用于治疗心肌梗塞和缺血性中风性疾病。近年来，对其在脑缺血再灌注损伤中所起的保护作用研究较多，其防治缺血性脑病的机制可能与清除氧自由基、影响脑组织诱导型一氧化氮合酶、降低皮层钙凋磷酸酶和钙蛋白酶活性、诱导脑缺血再灌注后神经细胞HSP70合成增加等方面有关。现在众多的对葛根素拮抗钙通道的研究多是通过酶学或形态学、免疫组化等方法而获得的，本项研究运用膜片钳技术，旨在从离子通道角度来阐明葛根素防治缺血性脑病的机制。 一、葛根素对正常大鼠海马CA1区锥体细胞L-型Ca2+通道的作用 目的：观察不同浓度葛根素对正常大鼠海马CA1区锥体细胞L-型Ca2+离子通道的作用。 方法：采用酶加机械分离的方法，急性分离出成年大鼠海马CA1区锥体细胞后，将含有锥体细胞的细胞悬液滴加于盖玻片上，待贴壁后选取符合实验条件的细胞，运用膜片钳单通道技术记录同一钳制电压下离子通道活动情况。 结果：采用110mmol·L-1Ba2+作为载离子时，L-型Ca2+通道电流幅度为1.5pA左右，电导大约为26pS。当葛根素为低浓度(1.2、2.4mmol·L-1)时，开放时间无明显变化(P＞0.05)；浓度达到4.8、9.6mmol·L-1时，L-型Ca2+通道平均开放时间由对照组的12.332±0.567ms分别减少到7.963±0.166ms和4.523±0.128ms(P＜0.05)；当浓度进一步增加到19.2mmol·L-1时，通道平均开放时间降至3.274±0.217ms(P＜0.05)。葛根素浓度为1.2、2.4mmol·L-1时，开放概率与对照组相比无明显差别(P＞0.05)。当浓度达到(4.8，9.6mmol·L-1)时，通道开放概率由对照组的0.0010400±0.0002408分别减小到0.0005620±0.0000259和0.0003460±0.0000321(P＜0.05)，随着浓度的增加(19.2mmol·L-1)，开放概率降至0.0002520±0.0000295(P＜0.05)。 结论：高浓度葛根素可以抑制正常大鼠海马CA1区锥体细胞L-型Ca2+离子通道，减少通道开放时间，降低通道开放概率，在一定范围(4.8，9.6，19.2mmol·L-1)成浓度依赖性。 二、脑缺血再灌注损伤对大鼠海马CA1区锥体细胞L-型Ca2+通道的影响 目的：观察缺血再灌注损伤后，不同时点大鼠海马CA1区锥体细胞L-型Ca2+通道特性的变化。 方法：本实验采用改良Pulsinelli四血管闭塞法制作大鼠全脑缺血模型，随机分为7组：(1)正常组；(2)模型组：共分为6个时间点，即再灌注0时点(缺血组)、0.5h、1h、6h、12h、24h，各时间点均为一组。按实验分组，在上述时点急性分离出成年大鼠海马CA1区锥体细胞后，采用膜片钳技术的细胞贴附模式记录同一钳制电压下离子通道活动情况。 结果：在本研究观察的时点内，再灌注24h时的开放概率升高为0.005667±0.001560，显著高于正常组0.001467±0.000398，其余时点与正常组相比较无差异；再灌注0h(缺血组)、6h、12h、24h时通道平均开放时间分别为28.043±9.152ms、34.850±7.864ms、21.205±4.921ms、32.980±7.228ms显著高于正常组12.565±1.366ms；再灌注0.5h、1h又分别回落到17.538±4.746ms和12.750±1.502ms，与正常组相比无显著性差异；再灌注0.5h，通道电流幅度为1.322±0.206pA，明显高于正常组0.931±0.155pA，有统计学意义，其余各组与正常组相比较无明显差异。 结论：缺血期(再灌注0h)以延长通道开放时间为主，再灌注早期(0.5h)以通道电流幅度增大为主，再灌注中期(6h、12h)以延长通道开放时间为主，晚期(24h)为延长通道开放时间和开放概率同时作用。这说明：在不同时点，脑缺血再灌注损伤对L-型Ca2+通道影响的主要机制不同。 三、葛根素对脑缺血再灌注损伤大鼠海马CA1区锥体细胞L-型Ca2+通道的影响 目的：研究脑缺血再灌注损伤后，葛根素对不同时点大鼠海马CA1区锥体细胞L-型Ca2+通道的影响。 方法：造模同实验二，实验随机分为13组：(1)正常组；(2)模型组：共分为6个时间点(同实验二)，各时间点均为一组；(3)葛根素组：时间点分组同上。葛根素组在夹闭颈总动脉前15分钟，给大鼠腹腔注射葛根素60mg/kg，正常组、模型组在夹闭颈总动脉前15分钟，给大鼠腹腔注射同等量的生理盐水。按实验分组，在上述时点急性分离出成年大鼠海马CA1区锥体细胞后，采用膜片钳技术的细胞贴附模式记录同一钳制电压下离子通道活动情况。 结果：用药后在本研究观测的时点内，开放概率无一高于正常组水平；通道平均开放时间，除0h和24h明显延长到16.433±12.351ms、24.423±2.027ms(P＜0.05)外，其余各个时点的平均开放时间与正常组12.565±1.366ms相比较无明显变化；通道电流幅度的变化不明显，只有再灌注0.5h，电流幅度明显增加到1.311±0.246pA(P＜0.05)。 通过对同一时点用药前后的比较，我们发现：开放概率在再灌注1h、12h、24h时，分别下降到0.000400±0.000268、0.000933±0.000250、0.001467±0.000476(P＜0.05)；各个时点通道电流幅度，在用药前后均没有明显的变化(P＞0.05)；再灌注0.5h组、6h组、12h组、24h组用药后，通道平均开放时间分别下降到9.565±2.018ms、15.952±3.500ms、14.909±4.140ms、24.423±2.027ms，与用药前相比具有统计学意义(P＜0.05)。 结论：在缺血期(再灌注0h)，葛根素可能是通过降低开放概率(甚至低于正常组)来影响通道开放时间；再灌注早期(0.5h)，由于葛根素不影响电流幅度，故推测在该时点它对通道不起作用；再灌注中期(6h、12h)，葛根素通过缩短通道开放时间，使其恢复到正常水平；再灌注晚期(24h)，葛根素可以使开放概率下降到正常水平，并一定程度缩短开放时间。 综合上述三个实验，可得出以下结论：葛根素通过影响L-型Ca2+通道的可利用性和/或开放特性，来抑制通道的开放，减少Ca2+内流，降低细胞内钙超载，从而保护神经细胞。

目录

文摘

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引言

第一章研究背景

第二章实验研究

结语

参考文献

附录

致谢