幽门螺杆菌DNA旋转酶gyrB与大肠杆菌gyrA、gyrB基因的克隆和表达

摘要

目的：细菌DNA旋转酶为喹诺酮类和氨基香豆素类抗菌药的作用靶点。利用细菌DNA旋转酶活性蛋白构建的模型，已被成功用于化合物旋转酶抑制活性的检测。许多中药具有很好的抗菌效果，但其作用机理并不明确。利用DNA旋转酶活性检测模型不仅可以高效地筛选中药中旋转酶抑制剂，同时也有助于中药抗菌药效物质基础和作用机理的阐明，进一步有可能研制出靶点明确、机理清楚的中药新药。本研究工作旨在对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）及大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）DNA旋转酶 A、B亚单位（GyrA，GyrB）进行克隆、表达和纯化，拟用于从复杂中药中筛选对该酶有抑制作用的有效部位或成分。
　　方法：⑴根据GenBank公布的HP gyrB序列以及E. coli gyrA、gyrB序列，设计特异性PCR引物，分别以HP J99和E. coli DH5α基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到HP gyrB以及E. coli gyrA、gyrB基因片段。⑵将PCR产物回收、纯化后连接T载体，转化E. coli DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性进行蓝白筛选，并通过提取质粒、酶切、琼脂糖凝胶电泳、测序、序列比对等方法筛选和鉴定阳性重组子。⑶分别对携带HP gyrB、E. coli gyrA和gyrB的克隆质粒进行双酶切处理，电泳分离、回收、纯化得到双粘末端目的DNA片段，连接到经过相同双酶切处理的原核表达载体pRSETB，转化E. coli DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子，并通过提取质粒、酶切、琼脂糖凝胶电泳、测序、序列比对等方法筛选和鉴定阳性重组子。⑷分别将携带HP gyrB、E. coli gyrA和gyrB的原核表达质粒转化宿主菌E. coli BL21（DE3）pLysS，通过氨苄青霉素、氯霉素抗性筛选以及提取质粒、酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得阳性菌落；接种单菌落，以IPTG进行诱导表达，并用Ni2+亲和柱纯化N-末端含His6标签的融合蛋白，通过SDS-PAGE对蛋白表达及纯化情况进行分析鉴定。
　　结果：①根据琼脂糖凝胶电泳结果，PCR产物与预期一致，可初步判断成功扩增 HP J99 gyrB、E. coli DH5αgyrA和gyrB基因片段，长度分别为2335bp、2678bp和2488bp。②单、双酶切，琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明，成功构建了携带HP J99 gyrB、E. coli DH5α gyrA和 gyrB的克隆质粒 pGEM-HPgyrB、pGEM-ECgyrA和pGEM-ECgyrB。通过 BLASTN检索，pGEM-HPgyrB中，gyrB基因核苷酸序列与GenBank登记的 HP J99菌株 gyrB基因序列同源性为99.8%（2317/2322）；pGEM-ECgyrA和pGEM-ECgyrB中，gyrA和gyrB基因核苷酸序列与E. coli K12菌株gyrA和gyrB基因序列同源性分别为99.7%（2621/2628）和99.9%（2412/2415）。③单、双酶切，琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明，成功构建了携带HP J99 gyrB、E. coli DH5α gyrA和 gyrB的原核表达质粒 pRSETB-HPgyrB、pRSETB-ECgyrA和pRSETB-ECgyrB，开放阅读框均正确，分别编码773、864和804个氨基酸，与HP J99菌株GyrB、E. coli K12菌株GyrA和GyrB氨基酸序列同源性分别为99.5%（768/773）、99.4%（859/864）和99.6%（801/804），相应的N-末端含His6标签融合蛋白的理论分子量分别为92.0KDa、100.8KDa和96.3KDa。④SDS-PAGE结果显示，携带原核表达质粒pRSETB-HPgyrB的E. coli BL21（DE3） pLysS经IPTG诱导表达后，小量制备全菌破碎液，在92.0KDa处没有明显表达条带，而在活性条件和变性条件下纯化得到的融合蛋白产物表观分子量分别为75KDa和92KDa，前者与预期融合蛋白大小（92.0KDa）存在较大差别；携带原核表达质粒pRSETB-ECgyrA的大肠杆菌 BL21（DE3）pLysS经 IPTG诱导表达后，小量制备全菌破碎液，在100.8KDa处没有明显表达条带，而在活性条件和变性条件下纯化得到的融合蛋白产物表观分子量分别为80KDa和95KDa，均与预期融合蛋白大小（100.8KDa）存在差别。而原核表达质粒pRSETB-ECgyrB未能成功转化E. coli BL21（DE3）pLysS，未能进行诱导表达试验。
　　结论：成功克隆HP J99菌株gyrB、E. coli DH5α菌株gyrA和gyrB基因，并分别构建克隆质粒和原核表达质粒，为DNA旋转酶的原核表达奠定基础。然而，HP J99 gyrB、E. coli DH5αgyrA和gyrB这三个基因在大肠杆菌中的过量表达尚未成功。从HPJ99gyrB、E.coli DH5αgyrA诱导表达和融合蛋白纯化的预实验结果看来，SDS-PAGE中目的表达产物条带不明显以及融合蛋白纯化产物大小与预期的理论大小存在一定偏差，究其原因可能是目的蛋白存在细胞毒性或自身不稳定性，导致低水平的表达结果，有必要对培养方法和纯化方法作进一步优化，并且目的基因是否实现了原核表达尚未明确，还需通过 western-blot或酶活性反应试验等特异性更高的检测鉴定方法对融合蛋白产物作进一步的验证。

目录

声明

引言

1 研究背景

2 本研究工作的总体思路、主要研究方法和预期结果

第一章 幽门螺杆菌DNA旋转酶gyrB基因的克隆与表达

1.1 材料与方法

1.2 结果与分析

1.3 讨论

1.4 结论

第二章 大肠杆菌DNA旋转酶gyrA和gyrB基因的克隆与表达

1.1 材料与方法

1.2 结果与分析

1.3 讨论

1.4 结论

结语

参考文献

附录

附录Ⅰ 相关试剂盒使用说明

附录Ⅱ 序列比对和BLAST结果

附录Ⅲ 图表清单图片清单

附录Ⅳ 本研究工作中涉及的菌株和质粒

附录Ⅴ 英文缩略词

在学期间发表的学术论文

致谢