芎冰微乳鼻腔给药的脑靶向性及脑局部PK-PD结合模型研究

摘要

本课题为国家自然科学基金“微透析技术进行复方中药脑局部PK-PD模型的研究”（No.30873443）部分研究内容。课题组前期开发了芎冰微乳给药系统，药效实验表明其具有良好的抗脑缺血作用，并采用微透析采样技术研究了大鼠口服芎冰微乳后体内药动学特性。本研究在前期研究的基础上进一步采用微透析技术进行芎冰微乳鼻腔给药的脑靶向性研究，并在大鼠急性脑缺血模型体内进行脑局部PK-PD结合模型研究，分别从药动学以及药效学角度探讨鼻腔给药的可行性。
　　本研究的实验主要包括以下四部分：
　　1.芎冰微乳清醒大鼠鼻腔给药的脑内药动学研究
　　1.1.清醒大鼠微透析实验方法的建立
　　将脑部微透析引导管植入大鼠左侧大脑纹状体，植入小螺钉，以牙托粉固定。在标准环境中恢复3～5天，清醒状态下，将脑探针插入引导管中，固定于大鼠纹状体。实验结束后，取脑观察探针的植入的位置，冲洗探针、清醒装置的管路。
　　1.2.脑部微透析样品中TMP含量测定方法的建立
　　建立HPLC法测定TMP浓度的方法，所得回归方程Y=31393X+216.64，R2=0.9998，TMP的浓度在0.02558～2.5584μg/mL内线性关系良好，精密度RSD为1.04%，样品在12h内稳定性的RSD为1.23%，TMP的最低检测限为24pg。
　　1.3.脑部探针体内回收率及其稳定性考察
　　考察流速、浓度对体内回收率的影响，以及体内回收率的稳定性。结果表明随着流速的增加（1.0～2.5μL/min），TMP体内回收率呈降低趋势；TMP浓度在0.16～2.42μg/mL范围内变化对探针回收率基本没有影响；8h内回收率的RSD为5.56%。体内实验采样条件为流速1.5μL/min，前三个取样间隔为10min，以后每隔20min一个。
　　1.4.清醒大鼠脑内的药动学研究
　　以静脉给药和灌胃给药为对照，初步评价鼻腔给药的可行性。测定三种途径给药后TMP在清醒大鼠脑局部的药物浓度，用DAS2.1药动学软件计算药动学参数。结果三种给药途径TMP在脑内药动学过程均符合一室模型，灌胃给药TMP在脑组织中的局部生物利用度较低（F=18.61%）；静脉注射TMP入脑迅速，生物利用度最高，但代谢迅速，作用时间短；鼻腔给药F为59.18%，且脑内作用时间较长，具有一定的研究价值。
　　2.芎冰微乳鼻腔给药的脑靶向性评价
　　2.1.两种鼻腔给药方式微透析探针植入方法的建立
　　建立两种常用鼻腔给药方式情况下血液探针和脑探针植入的方法。
　　非手术鼻腔给药：先将血液探针植入大鼠颈静脉，将大鼠固定于脑立体定位仪，植入脑部探针，鼻腔给药。
　　手术鼻腔给药：先植入血液探针，再将引导管植入脑部，用牙托粉固定，插入脑部探针。将大鼠仰卧位固定，进行气管插管，结扎食管和气管上段，鼻腔给药。
　　2.2.血液、脑组织微透析样品中TMP含量测定方法的建立
　　建立HPLC法测定血液及脑组织透析液中TMP浓度的方法，所得回归方程Y=39802X-748.03，R2=0.9999，TMP的浓度在0.0319～0.319μg/mL内线性关系良好，专属性良好。
　　2.3.血液、脑探针体内回收率稳定性考察
　　大鼠手术状态下血液及脑部探针的体内回收率在10h内保持稳定，其RSD分别为2.07%、5.08%，符合微透析采样的前提要求。
　　2.4.鼻腔给药方法优选
　　手术鼻腔给药与非手术鼻腔给药的AUCbrain/AUCblood比值分别为0.88和0.90，两者的脑靶向性没有显著性差异，但手术鼻腔给药给药剂量准确，药物与鼻粘膜充分接触，更有利于鼻腔给药的脑靶向性研究，确定采用手术鼻腔给药。
　　2.5.鼻腔给药脑靶向性的评价
　　以灌胃、静脉注射给药为对照，评价鼻腔给药的脑靶向性。结果灌胃给药TMP在血液、脑内的药动学过程均符合一室模型，鼻腔、静注给药均符合二室模型。灌胃给药绝对生物利用度(F)为41.89±5.16%，TMP在脑内的t1/2、MRT0-∞与鼻腔给药接近，但Cmax、AUC0-∞显著小于鼻腔给药，DTI=1.00，提示其脑靶向性不明显；鼻腔给药的F为86.60±2.02%，脑内的AUC0-∞与静注相比没有显著性差异，但显著延长了t1/2、MRT0-∞，DTI=1.13，提示部分药物可直接转运入脑，具有一定的脑内递药特性。
　　3.鼻腔给药脑靶向性的影响因素研究
　　3.1.处方因素对鼻腔给药脑靶向性的影响
　　TMP微乳、缺冰片微乳鼻腔给药的AUCbrain/AUCblood比值分别为0.82、0.85，结果表明川芎药材提取物、冰片均具有提高TMP的脑靶向性及增加脑内TMP的AUC的作用，复方在提高脑靶向性方面更具有显著性，从药动学角度验证了芎冰复方组方的合理性。
　　3.2.剂型对鼻腔给药脑靶向性的影响
　　芎冰混悬液鼻腔给药后TMP在血液中呈现二室模型，在脑中呈一室模型，其相对芎冰微乳的相对生物利用度为67.34%，AUCbrain/AUCblood比值为0.75，提示微乳作为药物载体在提高药物脑内浓度的潜在作用。
　　3.3.麻醉因素对药物入脑的影响
　　三种给药途径给药后，在麻醉状态下消除速率（CL）均明显减慢，均显著延长了药物的t1/2、MRT0-∞，提高了Cmax、AUC。麻醉对TMP在脑组织中的药动学参数产生了明显的影响。
　　4.芎冰微乳脑局部PK-PD结合模型的研究
　　4.1.大鼠急性脑缺血模型的建立
　　本实验采用改良Zea Longa线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型，通过神经行为学评分和TTC染色方法对缺血模型效果进行评价。结果证明本方法可以有效地阻断大鼠大脑中动脉供血区的脑血流，造成大脑局灶性缺血。本手术操作简单易行，成功率较高。
　　4.2.微透析样品中氨基酸类神经递质含量测定方法的建立
　　建立高效液相-荧光检测器系统（HPLC-FLD）OPA柱前衍生的方法测定脑透析液中兴奋性氨基酸（Asp、Glu）以及抑制性氨基酸（Cly、Tau、GABA）这五种氨基酸类神经递质的含量测定方法，所得回归方程的线性相关性均良好，仪器日内、日间的精密度良好。
　　4.3.鼻腔给药脑局部PK-PD结合模型的研究
　　实验将大鼠随机分为两组：芎冰微乳鼻腔给药组（给药剂量以TMP计算为4mg/kg）、模型组。给药组每份样品分为两份，一份用于测定药物动力学指标成分TMP的含量，另一份用于测定药效动力学指标氨基酸类神经递质的含量；模型组只测定氨基酸类神经递质。实验结果表明芎冰微乳鼻腔给药后可以显著降低大鼠脑缺血后EAA的含量，提高了IAA浓度的增加幅度，减轻兴奋毒性，发挥神经保护的作用。
　　用药动学软件WinNonlin4.0.1对鼻腔给药组所得数据进行药动学和药效动力学分析，结果TMP在脑局部符合一室开放模型，最佳药效动力学模型为Sigmoid-Emax模型。选取适当的参数，拟合出PK-PD结合模型，得到各个药效指标的量效方程，可用于预测TMP在脑部浓度和效应随时间变化的规律。
　　综上所述，芎冰微乳鼻腔给药相比灌胃给药可以显著提高清醒大鼠脑局部TMP的生物利用度。结合血液及脑部微透析采样技术，进一步评价鼻腔给药的脑靶向指数为1.13，具有一定的脑内递药特性，脑内的AUC与静注相似，有望成为一种新的给药途径。同时验证了复方组方的合理性以及微乳作为药物载在提高药物脑内浓度的潜在作用。最后通过同步测定脑缺血局部的药动学指标和药效学指标，从药效学角度评价鼻腔给药可以调节脑缺血后EAA、IAA的浓度，发挥神经保护的作用，同时建立脑局部PK-PD模型，得到各个药效指标的量效方程。本课题建立的方法为具有脑靶向特性的同类药物的脑内药动学、脑靶向性评价、药效学评价以及PK-PD模型研究提供了新的思路与科学的参考依据。

目录

声明

引言

第1章 文献综述

1.1 芎冰制剂的研究概述

1.2 鼻腔给药系统的研究

1.3 微透析采样技术的研究概述

1.4 PK-PD结合模型的研究进展

第2章 芎冰微乳清醒大鼠鼻腔给药的脑内药动学研究

2.1 仪器、试剂与动物

2.2 清醒大鼠微透析实验方法的建立

2.3 脑透析液中TMP测定方法的建立

2.4 脑部探针体内回收率考察

2.5 实验方法

2.6 实验结果

2.7 讨论

2.8 小结

第3章 芎冰微乳鼻腔给药的脑靶向性评价

3.1 仪器、试剂与动物

3.2两种鼻腔给药方式微透析探针植入方法的建立

3.3 透析液中TMP测定方法的建立

3.4 血液探针与脑探针体内回收率稳定性考察

3.5 鼻腔给药方法的优选

3.6 鼻腔给药脑靶向性的评价

3.7 讨论

3.8 小结

第4章 鼻腔给药脑靶向性的影响因素研究

4.1 仪器、试剂与动物

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 芎冰微乳鼻腔给药脑局部PK-PD结合模型的研究

5.1 仪器、试剂与动物

5.2 大鼠急性脑缺血模型的建立

5.3 微透析样品中TMP及药效指标含量测定方法的建立

5.4 实验方法

5.5 实验结果

5. 6 讨论

5.7 小结

结语

1研究结论

2本课题研究的特色与创新性

3 后续研究的设想

参考文献

在校期间已发表或录用的论文

致谢