落新妇苷固体分散体的制备、药物吸收及药物动力学研究

摘要

落新妇苷是一种二氢黄酮类化合物，可以作为一种新的免疫抑制剂用于免疫相关疾病的治疗，具有巨大的社会利益和经济价值，其研究对医药领域有着重要的意义。但落新妇苷为水难溶性药物，不易被机体吸收，生物利用度低，在临床应用上受到了一定限制。因此，如何增加落新妇苷溶解度及生物利用度是扩大其临床应用的重点也是目前药剂学研究的难点之一。本文旨在运用固体分散技术改善落新妇苷溶解度及生物利用度，为扩大落新妇苷应用提供依据。本研究主要内容包括：
　　⑴对落新妇苷的提取纯化工艺进行了较系统的探讨和研究。首先以土茯苓总黄酮、落新妇苷的含量为指标，考察乙醇浓度、提取时间、提取次数、溶剂用量4个因素对土茯苓中落新妇苷的提取工艺的影响。研究结果表明，各因素对试验结果的影响的大小顺序为乙醇浓度＞提取时间＞提取次数＞溶剂用量。确定最佳提取工艺条件为12倍量60%乙醇溶液回流提取2次，每次2小时。土茯苓中提取的落新妇苷并不稳定存在于土茯苓中，而因不同来源、产地、药材的不同而有差异，土茯苓中落新妇苷含量差异为1.1~25.13mg/g（0.11%-2.51%）。应用大孔吸附树脂分离纯化落新妇苷，通过测试它们对落新妇苷黄酮的吸附率、吸附速率、解吸率和产物得率及其黄酮含量，研究6种不同类型吸附树脂对土茯苓中落新妇苷黄酮的吸附特性。结果发现HPD400树脂对落新妇苷黄酮吸附量大，吸附快、解吸容易，吸附后产物黄酮含量高。可见HPD400、AB-8弱极性树脂是一种性能良好的土茯苓黄酮吸附剂，可用于从土茯苓提取物中富集总黄酮和落新妇苷，制备含量达78%以上的总黄酮和35%以上落新妇苷。样品经聚酰胺柱层析，用纯化水、20%、40%、60%乙醇洗脱，得到落新妇苷含量为80%以上的精制品。聚酰胺对落新妇苷有较好的吸附力，其水洗脱物中几乎不含落新妇苷。虽然95%乙醇可将残留在聚酰胺柱上的杂质洗去一些，但随着吸附与洗脱次数的增加聚酰胺对黄酮的吸附力逐渐下降，洗脱物中落新妇苷的含量均有明显下降。因此应根据需要使用几次后对聚酰胺进行有机溶剂再生处理或更换新的聚酰胺。精制品过葡聚糖凝胶柱色谱经80%甲醇洗脱纯化，制得落新妇苷的纯品，样品经过理化性质和波谱性质的测定、化学结构鉴定，证实得到纯度为95%以上的高纯度的单体化合物落新妇苷。该提取纯化工艺稳定性较好，科学可行。
　　⑵从提高难溶性药物溶解度的技术入手，证明了将落新妇苷制成固体分散体的可行性和科学性，深入探讨了落新妇苷固体分散体的制备方法和工艺。在处方前研究中，首先建立了完善的分析方法体系，并对原料药的理化性质进行考察，为固体分散体可行性方案的制定提供了科学的依据，此外还建立了完整的固体分散体评价指标。在落新妇苷固体分散体的制备中，采用溶剂法和溶剂-熔融法作为成型技术，以 PVP K30/C15、吐温80- PVP K30/C15作为载体材料，制备出的各种溶出度都较落新妇苷原药有显著提高的固体分散体，最终确定处方（落新妇苷:吐温80：PVPK30=1：1.5：3）最优。对优化后的的固体分散体进行存在状态、稳定性等质量评价。通过采用热力学分析法、X晶体衍射、显微镜法等研究方法对固体分散体的物相进行鉴别，发现落新妇苷在固体分散体以微晶态的形式存在。采用影响因素稳定性实验，以高温、高湿、强光照为三个因素，对自制的固体分散体进行质量评价。结果显示固体分散体在常温条件下稳定性良好。因此自制出落新妇苷固体分散体的增溶效果理想、质量稳定、工艺可行。以自制不同时间灯盏花素缓释片累积释放百分比数据为例，探讨多种溶出度释药模型拟合的简便方法。结果发现用Excel软件对统计数据进行处理，已经大致全部包含我们平时所需的各种模型，数据准确，图文并茂，且同以往的手工处理和查表计算相比大大加快了数据处理速度，操作简便，便于推广。采用此法对落新妇苷原料药和固体分散体的释药曲线进行拟合，结果表明Weibull方程拟合度最高，落新妇苷、固体分散体分别为0.9944、0.9986。通过增溶及溶出度增加机制探讨，可见固体分散体恰恰是在于载体抑制了已被固体分散法高度分散的粒子聚集趋势(抑晶性)，表面积扩大；另外载体本身对药物的溶出有促进作用，因此固体分散体较原药物的溶解度大大提高，改善了其溶出速率，促进了药物的吸收和生物利用度。
　　⑶建立了Caco-2细胞模型。细胞生长良好均匀，边界清晰，细胞间形成紧密连接且完整。跨膜电阻随着培养时间的增加而增大，在培养21天后TEER>500??cm-2，已形成完整的细胞单层。AP侧与BL侧的碱性磷酸酶活性(ALP)分别为46.371±5.902、5.286±0.86，腔面的碱性磷酸酶是基底侧的8.77倍，两者有显著性差异(P<0.01)，说明细胞生长已经形成了极性，碱性磷酸酶已经大部分集中于刷状缘一侧(AP侧)，即朝向培养基的一侧.普萘洛尔的Papp值为(2.193±0.170)×10-5 cm/s（参考值为(2.397±0.630)×10-5 cm/s）。该模型具备单细胞层紧密性与完整性，完全符合药物转运实验的要求，可用以模拟体外小肠吸收特征的研究。对于落新妇苷和固体分散体，细胞存活率随着药物浓度的增加逐渐下降，细胞增殖抑制作用明显增强，呈现剂量依赖性。在5～400μg/mL浓度范围内，两者的细胞存活率在80%以上，固体分散体的细胞存活率均比原料药的低但无显著性差异，5～400?μg/ml是Caco-2细胞的安全浓度范围。运用Caco-2细胞模型考察了固体分散系统中PVP的浓度，PVP和表面活性剂(Tween-80)共存等因素对落新妇苷吸收的影响。不同剂量落新妇及自制固体分散体中药物的表观渗透系数随着剂量的增加而增加，不同落新妇苷用量对表观渗透系数的影响无显著性差异，固体分散体中不同落新妇苷用量对表观渗透系数的影响有显著性差异（P=0.005）。载体及表面活性剂对药物的表观渗透系数有显著性影响，PVP k30促进药物渗透效果最佳（P=0.017），FEG4000、F68作用不明显。固体分散体载体用量对药物的表观渗透系数的影响有显著性差异（P=0.006），载体量增加到一定程度，药物表观渗透系数不再增加，其中药物：载体为1:3时促进药物通透效果最佳，药物：载体为1:6时次之，药物：载体为1:1时最差。载体联用表面活性剂能显著改善药物表观渗透系数（P=0.008），用量增加到一定程度，表观渗透系数反而下降，其中表面活性剂用量为1.5时最佳，表面活性剂用量为3时次之，表面活性剂用量为0时最差。固体分散载体类型、载体与药物比例、表面活性剂是影响落新妇苷表观渗透系数的关键因素。可见将落新妇苷制成固体分散体能改善药物渗透，提示可能提高药物体内吸收。
　　⑷采用液相色谱－串联质谱（LC/MS/MS）分析方法测定血浆样品中落新妇苷含量，并进行了方法确证。落新妇苷和内标葛根素[M-H]-去质子峰分别为m/z449.0和 m/z414.5，落新妇苷和内标葛根素生成的主要碎片离子分别为 m/z284.9和 m/z266.9，将其作为定量分析时监测的产物离子。本方法具有快速、准确、灵敏度高的特点，落新妇苷和内标葛根素的保留时间分别为1.7 min和1.8 min，线性范围为2.5 ng/ml-1000 ng/ml，定量下限为2.5 ng/ml，适合测定人血浆中落新妇苷的浓度，并成功应用到落新妇苷制剂的犬体内药代动力学研究。空白血浆中的内源性物质不干扰落新妇苷和内标葛根素的测定，精密度（RSD）均小于7.7%，相对偏差（RE）小于12.0%，准确度符合相关规定，落新妇苷在血浆浓度为5.0、50.0、500.0 ng/ml时的提取回收率分别为81.6?9.3%，82.2?3.6%，80.0?4.5%，内标的提取回收率为86.9?4.5%，低、中、高三种浓度下的基质效应分别为93.4?5.8%，96.1?3.4%，97.8?7.9%，内标的介质效应为102.1?3.2%，符合相关规定。本方法具有快速、准确、灵敏度高的特点，此分析方法符合中华人民共和国药典人体生物利用度指导原则和生物样品分析国际规范的有关要求，适合测定人血浆中落新妇苷的浓度，并成功应用到落新妇苷制剂的犬体内药代动力学研究。通过Beagle犬给药后学药浓度参数的比较，首次考察了落新妇苷及其固体分散体在Beagle犬体内的药动学行为及其生物利用度，血药浓度经时过程可经非隔室模型描述。原料药Tmax、Cmax、AUC0-t、T1/2、Ke分别为1.667±0.258（h）、71.050±34.251（ng/mL）、133.186±49.071（ng/mL·h）、3.38±3.19（h）、0.31±0.16（1/h）；固体分散体Tmax、Cmax、AUC0-t、T1/2、Ke分别为2.583±0.665（h）、122.550±52.740（ng/mL）、298.642±173.673（ng/mL·h）、1.106±0.218（h）、0.65±0.12（1/h）。这部分研究内容充实了落新妇苷药代动力学方面的资料，为进一步临床药代动力学研究提供了参考依据。药动学方差分析结果表明，原料药及固体分散体之间AUC0-t、Tmax、Cmax间均有显著性差异，T1/2、Ke间均无显著性差异。说明同等药物浓度条件下，固体分散技术能显著改善原料药的Cmax和生物利用度，延长达峰浓度时间（Tmax），但对药物的消除速率常数和半衰期无影响。通过两者Cmax、AUC(0-t)、AUC(0-∞)分别计算相对生物利用度分别为1.8、212.4%、192.0%，提示固体分散技术能提高落新妇苷的生物利用度，落新妇苷固体分散体采用较低的剂量可以达到同样的血药浓度和疗效。

目录

声明

引言

一、选题依据

二、研究内容

三、创新性

四、研究方案设计

第一章 文献研究

1.1 落新妇苷来源概述

1.2 体外Caco-2细胞模型在药物制剂研究中的应用

1.3 固体分散技术在药物制剂中的应用

第二章 落新妇苷提取分离纯化工艺研究

2.1 仪器、药品、材料和试剂

2.2 土茯苓总黄酮及落新妇苷含量测定方法

2.3 土茯苓提取工艺研究

2.4 大孔树脂初步纯化工艺研究

2.5 采用柱层析精制落新妇苷工艺研究

2.6 落新妇苷提取纯化方法及工艺流程

2.7 落新妇苷对照品鉴定与分析

2.8 本章小结

第三章 落新妇苷固体分散体研究及评价

3.1 仪器、药品、材料和试剂

3.2 处方前研究

3.3 落新妇苷固体分散体处方工艺研究

3.4 落新妇苷固体分散体质量评价

3.5 固体分散体溶出释放机理探讨

3.6 本章小结

第四章 落新妇苷及SD在Caco-2细胞模型中吸收机制

4.1 仪器、药品、材料和试剂

4.2 供试液中落新妇苷含量的测定方法

4.3 Caco-2细胞模型的建立与评价

4.4 MTT法检测落新妇苷和SD对Caco-2细胞的增殖抑制作用

4.5 Caco-2细胞转运研究方法及评价指标

4.6 本章小结

第五章 落新妇苷及SD Beagle犬体内生物利用度评价

5.1 仪器、药品、材料和试剂

5.2 Beagle犬体内血药浓度分析方法的建立

5.3 实验动物及给药方案

5.4 试验结果及数据分析

5.5 本章小结

结语

1、落新妇苷重要的研究意义及应用局限性。

2、模型药物的获得及增容技术工艺的选择

3、 首次采用 Caco-2 细胞模型评价固体分散体载体系统对落新妇苷转运吸收影响。

5、首次对落新妇苷及其固体分散体的 beagle 犬体内药物动力学进行对比研究

参考文献

附录 缩略语

研究生在校期间发表论文

致谢