基于肠细胞生长及健脾中药效应的RPS20基因功能鉴定

摘要

研究背景和目的：
　　脾虚证是中医辨证的常见证型，现代医学认为脾虚证的临床表现多与消化吸收和代谢功能异常相关，国内外学者从消化系统、免疫系统、物质能量代谢等角度对脾虚证进行了大量的探索研究，初步阐释脾虚证的现代病理生理学基础。由于中医证候具有系统性和复杂性，局部的研究难以全面地反映脾虚证的本质。近年来，基于基因组学技术的中医证候基因差异表达谱研究，可从整体水平反映中医证候的生物学基础，应用基因芯片等技术对中医证候差异表达基因的探讨分析为阐明中医证候的本质提供了新的思路和方法，并取得了一定的进展。
　　本实验室在前期课题对慢性浅表性胃炎脾虚证患者胃粘膜基因差异表达谱的研究中发现，脾虚证患者核糖体蛋白 S20（RPS20）等基因表达出现下调趋势，并通过荧光定量PCR验证了RPS20等基因的表达下调呈阳性结果。后续对RPS20基因的体外功能研究结果初步表明核糖体蛋白基因在脾虚证发生发展过程中可能具有重要作用，RPS20基因RNA干扰后大鼠小肠上皮细胞（IEC-6）的形态结构发生改变，细胞的迁移、增殖能力受到抑制，提示RPS20基因表达下调可能影响小肠上皮细胞的消化吸收和粘膜损伤修复功能。此外通过小鼠结肠腺癌细胞（CT26）筛选了针对小鼠RPS20基因的RNA干扰有效序列，重组构建慢病毒RNA干扰表达载体，以期在动物体内对RPS20基因进行后续的功能研究。
　　本研究将在前期研究的基础上进一步开展RPS20基因的功能鉴定，通过考察益气健脾中药对PRS20基因RNA干扰后IEC-6细胞受损的形态和功能的作用，从“药物作用”的角度反证前期的研究结果，进一步探讨研究RPS20的基因功能，以支持课题组前期的研究发现。此外，根据前期构建的RNA干扰表达载体包装RNA干扰慢病毒，考察其转染后对 CT26细胞生长的影响，进一步验证前期所筛选的RNA干扰序列的有效性，并为后续在小鼠体内采用RNA干扰技术进行RPS20基因功能研究提供技术参考。
　　研究方法：
　　1.采用siRNA转染IEC-6细胞对RPS20基因进行RNA干扰，给予益气健脾中药提取物作用后，检测IEC-6细胞的增殖和迁移能力、细胞形态结构、RPS20表达情况和细胞内的多胺含量。
　　（1）IEC-6细胞生长情况的考察：分别采用细胞计数法和xCELLigence实时细胞分析仪（RTCA）考察 IEC-6细胞的生长曲线，为后续实验选择合适的细胞接种密度和实验干预时间点提供参考。
　　（2）选择 RNA干扰的转染条件：在前期合成的siRNA干扰序列的基础上加入荧光表达序列，设置不同的转染条件，采用RTCA检测转染后IEC-6细胞的生长情况，以转染后细胞的生长情况直接反映 RNA干扰的效果，并结合转染后细胞的荧光表达情况选择合适的转染条件。
　　（3）健脾中药对IEC-6细胞增殖能力的作用：采用RTCA检测益气健脾中药黄芪、甘草、党参提取物对正常IEC-6细胞和RNA干扰后IEC-6细胞增殖能力的影响，并选择作用效果较明显的中药提取物进行后续实验研究。
　　（4）健脾中药对 IEC-6细胞迁移能力的作用：采用 IEC-6细胞划痕损伤迁移模型，研究黄芪提取物对正常IEC-6细胞和RNA干扰后IEC-6细胞在划痕损伤后迁移能力的影响。
　　（5）健脾中药对 IEC-6细胞形态结构的作用：分别采用光学显微镜和透射电镜观察RNA干扰和给予黄芪提取物作用后IEC-6细胞形态和结构的变化情况，考察中药对RNA干扰后IEC-6细胞受损的形态结构的恢复作用。
　　（6）健脾中药对IEC-6细胞RPS20表达水平的作用：分别采用荧光定量PCR和Westernblot检测RNA干扰和给予黄芪提取物作用后IEC-6细胞中RPS20 mRNA和蛋白的表达水平。
　　（7）健脾中药对IEC-6细胞中多胺含量的影响：对RNA干扰和黄芪提取物作用后的IEC-6细胞进行样品处理，采用苯甲酰氯柱前衍生反相高效液相色谱法检测各样品中精脒的含量。
　　2. RNA干扰慢病毒对CT26细胞生长的影响：将前期重组构建的针对CT26细胞的慢病毒表达载体与慢病毒包装试剂共转染293FT细胞，包装获得RNA干扰慢病毒，测定病毒滴度并将其转染CT26细胞，采用RTCA检测转染后细胞的生长情况，研究RNA干扰慢病毒对CT26细胞生长的影响。
　　研究结果：
　　1. RNA干扰IEC-6细胞和益气健脾中药的作用：
　　（1）IEC-6细胞的生长情况：细胞计数法绘制以1×104cells/well的密度接种于24孔培养板中IEC-6细胞的生长曲线，细胞从接种的第3天开始进入对数生长期，接种后第10天进入缓慢生长的平台期；RTCA检测得到不同接种密度的23代和26代IEC-6细胞的生长曲线，在相同接种密度条件下，23代和26代的IEC-6细胞生长趋势相似，随着接种密度的增大，细胞生长达到平台期的时间缩短。
　　（2）RNA干扰的转染条件：RTCA检测结果发现高剂量和中剂量的转染试剂（Lipofectamine2000）对细胞生长有明显毒害作用；不同剂量组合的转染混合物在转染初期对IEC-6细胞生长的抑制作用相近，但在相同转染试剂用量时siRNA剂量的增加能延长对细胞生长抑制作用的持续时间。结合荧光表达的情况，最后选择 RNA干扰的转染条件为：E-Plate16培养板中每孔加入0.3μL的Lipofectamine2000和16pmol的siRNA（浓度分别为1.5mg/L和80nmol/L）。
　　（3）健脾中药对IEC-6细胞增殖能力的作用：黄芪和党参提取物能促进正常IEC-6细胞的增殖，甘草对正常IEC-6细胞的作用不明显；RNA干扰后IEC-6细胞的增殖能力下降，而黄芪、甘草和党参提取物都能有效促进RNA干扰后IEC-6细胞的增殖，其中黄芪的效果较优。结果表明健脾中药可在一定程度上逆转RPS20基因干扰引发的IEC-6细胞增殖能力下降的病理表现。
　　（4）健脾中药对 IEC-6细胞迁移能力的作用：高剂量和中剂量的黄芪提取物能有效促进正常IEC-6细胞在划痕损伤后的迁移能力；RNA干扰后IEC-6细胞的迁移能力显著下降，经黄芪提取物作用后其迁移能力较转染模型组显著提高，但未能恢复到正常水平。结果表明RPS20基因干扰后IEC-6细胞受损的迁移能力可在健脾中药作用后得到一定程度的恢复。
　　（5）健脾中药对IEC-6细胞形态结构的作用：光学显微镜观察发现RNA干扰后IEC-6细胞数目减少，细胞形态改变，细胞间隙增大，给予黄芪提取物作用后细胞受损的形态得到不同程度的改善；透射电镜观察发现RNA干扰后IEC-6细胞胞浆中空泡和溶酶体数目增多，线粒体减少，经治疗后细胞受损结构得到一定程度的改善。
　　（6）健脾中药对IEC-6细胞RPS20表达的作用：RNA干扰后IEC-6细胞中RPS20 mRNA表达被显著抑制，给予黄芪提取物作用后其表达量有所提高，其中中剂量组与转染模型组比较具有显著差异性；RPS20蛋白表达在RNA干扰后被显著抑制，但经健脾中药作用后RPS20蛋白表达没有提高。
　　（7）健脾中药对 IEC-6细胞中多胺含量的影响：精脒对照品的回归方程为Y=25.69X－1.337，相关系数R=0.9998，精脒对照品在0.7600~7.600 nmol范围内线性良好。检测结果RNA干扰后IEC-6细胞中精脒含量比正常组增加，但无统计学意义；经黄芪提取物作用后的各组细胞中精脒含量较正常组显著增加，但与 RNA干扰模型组比较无明显差异。
　　2. RNA干扰慢病毒对CT26细胞生长的影响：慢病毒滴度为1.2×105TU/mL，RNA干扰慢病毒转染使CT26细胞指数的增长受到明显抑制，转染后30h细胞指数抑制率达到82.24%。结果表明根据前期筛选的RNA干扰序列包装获得的慢病毒转染后能有效抑制CT26细胞中RPS20的表达从而抑制细胞的生长。
　　结论：
　　根据xCELLigence RTCA检测结果和细胞荧光表达情况选择的RNA干扰条件转染IEC-6细胞，可有效抑制IEC-6细胞RPS20的表达，并抑制细胞的增殖和迁移能力，影响细胞的形态结构；给予益气健脾中药黄芪的提取物作用后可提高 RNA干扰后IEC-6细胞中RPS20 mRNA的表达，促进细胞的增殖和迁移，并在一定程度上改善细胞受损的形态结构；给予益气健脾中药作用后，能改善RPS20表达异常所导致的细胞形态和功能的异常，提示RPS20可能与脾虚证的症状表现之间存在一定联系，本研究从药物作用的角度进一步支持课题组前期对脾虚证差异表达基因的研究发现及对RPS20在IEC-6细胞的生物功能鉴定的研究结果；本研究可为中医证候差异表达基因的功能研究提供参考。
　　本研究还验证了前期针对CT26细胞重组构建的慢病毒表达载体可成功用于包装RNA干扰慢病毒，以其转染CT26细胞能有效抑制细胞的生长，提示RNA干扰慢病毒可能用于小鼠体内RNA干扰进行RPS20功能鉴定的后续研究。

目录

声明

引言

第一章 文献研究

第一节 脾虚证的现代研究

第二节 中医证候差异表达基因的研究进展

第三节 核糖体蛋白S20的研究概况

第四节 RNA干扰技术的研究概况

第五节 实时细胞分析系统的基本原理及应用

第二章 益气健脾中药对RPS20 RNA干扰后IEC-6细胞的作用

第一节 IEC-6细胞的生长情况研究

第二节 RNA干扰IEC-6细胞的转染条件选择

第三节 黄芪、甘草、党参提取物对IEC-6细胞增殖能力的作用

第四节 黄芪提取物对IEC-6细胞迁移能力的作用

第五节 黄芪提取物对RNA干扰后IEC-6细胞形态结构变化的作用

第六节 黄芪提取物对RNA干扰后IEC-6细胞RPS20表达的作用

第七节 黄芪提取物对RNA干扰后IEC-6细胞多胺含量的影响

第三章 RPS20 RNA干扰慢病毒对CT26细胞生长的影响

第一节 CT26细胞的接种密度考察

第二节 RPS20 RNA干扰慢病毒的包装和滴度测定

第三节 慢病毒转染对CT26细胞生长的影响

第四章 结语

一、讨论

二、结论

三、研究创新性

四、后续展望

参考文献

附录

在校期间发表论文和参与科研课题情况

致谢