阳春砂HMGR和DXR基因在烟草萜类化合物生物合成中的功能研究

摘要

目的：利用阳春砂萜类化合物生物合成途径上游2个关键酶HMGR和DXR的基因----AvHMGR和AvDXR，进行萜类化合物生物合成调控研究，在模式植物烟草中分析AvHMGR和AvDXR的生物功能，为应用AvHMGR和AvDXR进行阳春砂萜类生物合成的基因工程调控，从根本上提高阳春砂的药效品质提供科学依据。
　　方法：⑴以卡那霉素（kanamycin，Kan）初步筛选AvHMGR、AvDXR转基因烟草T1代植株，对转基因植株进行以Kan抗性基因nptⅡ和目的基因AvHMGR、AvDXR为靶标的PCR验证。观察转基因烟草和野生型对照烟草在形态和抗虫性方面的差异。⑵用半定量RT-PCR法，分别检测转基因烟草中的AvHMGR和AvDXR表达量。对AvHMGR和AvDXR基因超表达植株及其对照，采用专一底物，通过分光光度计法检测辅酶NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）的氧化速率来测定HMGR和DXR活性。⑶对AvHMGR、AvDXR转基因烟草及其野生型对照中的萜类化合物进行分类提取和定性定量分析。对光合色素中的类胡萝卜素（四萜类）和叶绿素（二萜类），采用丙酮提取，分光光度法测定含量；对挥发性萜类，主要是单萜、倍半萜和二萜类，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）提取，气质联用色谱（GC-MS）进行定性分析；对非挥发性萜类化合物，主要是三萜类植物甾醇、维生素E及二萜类植醇，采用二氯甲烷提取，GC-MS进行定量分析。
　　结果：①通过Kan初步筛选和PCR验证，外源基因可能以单拷贝的形式遗传至AvHMGR转基因烟草的H1、H3、H4、H5株系及AvDXR转基因烟草的D1、D2株系基因组中。共筛选得到AvHMGR转基因烟草T1代植株17株，AvDXR转基因烟草T1代植株12株。对植物形态进行观察发现，AvHMGR转基因烟草的H5株系的株高极显著高于野生型。AvDXR转基因烟草表现出抗虫性且茎有横向生长趋势。②经过检测，11株AvHMGR及8株AvDXR转基因烟草T1代植株外源基因获得超表达。酶活性测定结果显示，与野生型对照比较，AvHMGR超表达植株中有5株HMGR活性显著提高；AvDXR超表达植株中有2株DXR活性显著提高。③AvHMGR和AvDXR转基因烟草与对照比较，能检测到更多的挥发性单萜（薄荷烯）、倍半萜（檀香醇，AvDXR转基因烟草D2-1）及二萜（黑松醇，AvHMGR转基因烟草H3-3），并促进了光合色素（叶绿素和类胡萝卜素）、甾醇（豆甾醇、菜油甾醇）及植醇的合成。其中，AvDXR对MEP途径的光合色素生物合成的促进作用更为明显，同样，AvHMGR对MVA途径的甾醇生物合成的促进也更为明显。而超表达烟草中的β-谷甾醇和维生素E的含量与野生型比较有所降低。
　　结论：通过对萜类合成途径的上游不同关键酶基因HMGR和DXR的调控，均可促进下游萜类产物的合成，阳春砂AvHMGR和AvDXR基因在萜类生物合成途径中发挥重要作用，而AvHMGR和AvDXR分别超表达对不同萜类化合物的促进程度并不完全一致，与其在细胞内的不同定位有关，证明2条萜类合成途径之间既具有相对独立性，又存在着相互的关联和交流。本研究为应用AvHMGR和AvDXR进行阳春砂萜类生物合成的基因工程调控，从根本上提高阳春砂的药效品质提供了依据。

目录

声明

引言

1 研究背景

2 本研究工作的总体思路、主要研究方法和预期结果

第一章 AvHMGR、AvDXR转基因烟草T1代的筛选及形态观察

1 卡那霉素初步筛选AvHMGR和AvDXR稳定遗传的T1代转基因烟草植株

2 AvHMGR和AvDXR转基因烟草T1代植株的PCR检测

3 AvHMGR、AvDXR转基因烟草与野生型烟草的形态与抗虫性比较

本章小结

第二章 转基因烟草的AvHMGR、AvDXR表达量及酶活性分析

1 转基因烟草的AvHMGR、AvDXR表达量分析

2 AvHMGR、AvDXR超表达对转基因烟草HMGR、DXR活性的影响

本章小结

第三章 超表达AvHMGR、AvDXR对烟草萜类化合物生物合成的影响

1 超表达AvHMGR、AvDXR对烟草光合色素含量的影响

2 超表达AvHMGR、AvDXR对烟草挥发性萜类的影响

3 超表达AvHMGR、AvDXR对烟草甾醇和植醇含量的影响

4 AvHMGR、AvDXR超表达对烟草不同萜类化合物合成的影响比较

本章小结

第四章 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

附图

获资助项目

在校期间发表论文情况

致谢