基于阳春砂HMGR和DXR基因的萜类化合物生物合成调控研究

摘要

姜科Zingiberaceae豆蔻属植物阳春砂Amomum villosum Lour.是我国著名的“四大南药”之一砂仁的主流品种。砂仁芳香化湿、行气止痛的主要药效物质为挥发油，其主要成分为单。
　　植物萜类化合物的生物合成萜化合物至少有2条途径。一条是细胞质中的甲羟戊酸途径（mevalonate pathway, MVA途径），另一条是质体中的2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway, MEP途径）。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR）和1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase, DXR）分别是MVA和MEP上游途径中的2个关键酶。
　　目的：
　　通过对阳春砂萜类化合物生物合成途径的关键酶基因AvHMGR和AvDXR在模式植物烟草中共同和单独过量表达、对烟草施用专一抑制剂以及利用茉莉酸甲酯对阳春砂的诱导，分析萜类合成途径相关基因的表达及相互作用，探讨AvHMGR和AvDXR对不同萜类化合物合成的调控差异，论证HMGR和DXR在萜类化合物合成过程中的关键作用以及2条途径间的协同作用。
　　方法：
　　1、获得AvHMGR和AvDXR基因单独及共同超表达植株
　　对 AvHMGR和 AvDXR基因单独转化烟草 T2代及用农杆菌介导法构建的AvHMGR和AvDXR双基因转化烟草T1代，进行抗生素及PCR筛选。荧光定量PCR法测定外源基因AvHMGR和AvDXR、内源基因NtHMGR和NtDXR及下游基因法尼基焦磷酸合成酶基因（ FPPS）和香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因（GGPPS）表达量。专一底物法检测AvHMGR和AvDXR基因分别和共同过量表达的烟草中HMGR和DXR酶活性。
　　2、获得HMGR、DXR受抑制的野生型烟草植株
　　对野生型烟草施用HMGR和DXR的专一抑制剂MEV（洛伐他丁）和FSM（膦胺霉素），荧光定量PCR法测定内源基因NtHMGR、NtDXR及下游基因FPPS、GGPPS表达量变化。专一底物法测定施用抑制剂后烟草HMGR及DXR酶活性变化。
　　3、 MVA和MEP途径被促进或抑制后不同萜类化合物的分析
　　用石油醚提取烟草挥发性萜类，二氯甲烷超声法提取植物甾醇，气相色谱-质谱法（GC-MS）进行分析，用丙酮法提取萜类光合色素，分光光度法进行分析。
　　4、茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）对阳春砂萜类化合物的调控
　　利用不同浓度茉莉酸甲酯喷施阳春砂叶片，荧光定量 PCR法测定阳春砂AvHMGR和AvDXR基因表达量变化，用石油醚提取阳春砂叶片的挥发性萜类， GC-MS法分析含量变化。
　　5、综合分析
　　结合单基因、双基因超表达烟草、抑制剂处理烟草及茉莉酸甲酯处理阳春砂结果，分析MVA和/或MEP途径被促进或抑制后对不同萜类化合物代谢的影响。
　　结果：
　　1、获得AvHMGR和AvDXR基因单独及共同超表达植株
　　AvHMGR和AvDXR转基因烟草T2代、双基因转化烟草T1代中外源基因获得超表达，大部分烟草内源基因及下游基因表达量有所提高。AvHMGR和AvDXR单独超表达烟草T2代HMGR和DXR活性显著降低，部分共同超表达烟草HMGR、DXR活性显著提高。
　　2、获得HMGR、DXR受抑制的野生型烟草植株
　　抑制剂处理后烟草内源基因NtHMGR和NtDXR表达量在24 h受到明显抑制， HMGR和DXR活性均在一定时间内受到抑制，获得HMGR和DXR受抑制的烟草植株。
　　3、 AvHMGR和AvDXR基因单独及共同超表达对烟草萜类化合物生物合成的影响
　　AvHMGR和AvDXR在烟草中的单独超表达促进了单萜类化合物β-蒎烯，二萜类化合物五针松烯、新植二烯、黑松醇、植醇、维生素 E及三萜化合物甾醇（包括β-谷甾醇，豆甾醇，菜油甾醇）的合成，降低了单萜薄荷烯、萜类光合色素的含量，AvHMGR和AvDXR的共同超表达促进了部分植株类胡萝卜素合成，降低了部分植株叶绿素的含量。
　　4、抑制剂对野生型烟草萜类化合物生物合成及转基因烟草表型的影响
　　野生型烟草喷施HMGR或DXR的专一抑制剂MEV或FSM后，三萜化合物甾醇、单萜类化合物β-蒎烯和二萜类化合物新植二烯、黑松醇、植醇及维生素E的合成受到抑制。AvHMGR和AvDXR在烟草中的超表达可以抵抗MEV和FSM分别对烟草造成的皱缩及白化现象。
　　5、茉莉酸甲酯对阳春砂萜类合成的调控作用
　　高浓度的茉莉酸甲酯对阳春砂成苗中单萜成分（α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯、柠檬烯）的合成有长时间明显的促进作用，对倍半萜成分（β-石竹烯、α-石竹烯、香橙烯、双环大牻牛儿烯）合成促进时间较短。
　　结论：
　　本研究证实，通过促进或抑制萜类合成途径，对萜类化合物生物合成进行调控，可影响下游萜类化合物的合成。HMGR和DXR基因在植物萜类生物合成途径中发挥重要作用，基因超表达及抑制剂对萜类化合物合成的促进及抑制与2途径在细胞的定位基本相符，在一定程度上保持相对独立性，但又存在着相互关联和交流。本研究证实了HMGR和DXR在萜类化合物合成过程中的关键作用以及2条途径间存在的协同作用。

目录

声明

引言

1 研究背景

2 本研究工作的总体思路、主要研究方法和预期结果

第一章 AvHMGR和AvDXR基因单独超表达对烟草萜类化合物生物合成的调控

1 AvHMGR和AvDXR稳定遗传的T2代转基因烟草植株的筛选

2 AvHMGR和AvDXR转基因烟草基因表达量分析

3 AvHMGR、AvDXR超表达对转基因烟草HMGR、DXR活性的影响

4 AvHMGR、AvDXR超表达对转基因烟草不同萜类化合物含量的影响

本章小结

第二章 AvHMGR和AvDXR共同超表达对烟草萜类化合物生物合成的调控

1 AvHMGR和AvDXR双基因转化烟草的构建

2 双基因转化烟草AvHMGR、AvDXR表达量分析

3 AvHMGR和AvDXR共同超表达对转基因烟草HMGR、DXR活性的影响

4 AvHMGR和AvDXR共同超表达对萜类光合色素含量的影响

本章小结

第三章 抑制HMGR、DXR对烟草萜类化合物生物合成的调控

1 确定HMGR和DXR专一抑制剂MEV和FSM喷施烟草最适浓度和取样时间

2 MEV和FSM处理对转基因烟草表型的影响

3 喷施MEV和FSM对烟草基因表达量和酶活性的影响

4 HMGR和DXR受抑制后对烟草萜类化合物含量的影响

本章小结

第四章 茉莉酸甲酯对阳春砂萜类化合物生物合成的调控

1 茉莉酸甲酯调控阳春砂幼苗HMGR和DXR基因表达

2 茉莉酸甲酯对阳春砂成苗萜类化合物含量的影响

本章小结

第五章 总结与展望

1 HMGR和DXR对萜类化合物生物合成的调控作用

2 MVA途径和MEP途径的相互作用

3 研究展望

参考文献

获资助项目

在校期间发表论文情况

致谢