补阳还五汤对全脑缺血再灌大鼠皮层神经元GluR2/NR1/NR2B的影响

摘要

目的：
　　缺血性脑中风是临床常见病、多发病，其患病率、病死率、致残率非常高。我国每年约有120～150万人首次发生中风，约有80～100万人死于中风，存活者中约75%致残，5年内复发率高达41%。在中风患者中，缺血性脑中风就占75%～90%。
　　随着老龄化社会的到来，中风的发病率呈明显上升趋势，它已成为我国人口死亡的第一或第二位原因，并且有着年轻化的趋势。同时，该病还是一种高消费疾病。因此深入研究中风的防治机制，有着重大的社会和经济意义，特别是缺血性脑中风。
　　祖国医学认为，气虚血瘀是缺血性脑中风的主要病机，故治则应为益气活血。益气活血治法作为防治缺血性脑中风的主要方法，在临床上的应用得到了广泛认同与重视，有关其作用机制的实验研究也做了大量的工作，但目前仍存在一些问题，比如如何准确把握治疗的时间窗，如何细化观察指标，如何预防脑中风的发生等。如果能从细胞、分子、基因水平深入研究缺血性脑中风的病理生理及益气活血法的作用机制，将为有效发挥传统中医药防治缺血性脑中风的优势提供实验支持，并使该治法更具有实用性和可操作性。
　　补阳还五汤作为益气活血化瘀之代表方，临床用于治疗缺血性脑血管疾病及其后遗症取得了卓越的疗效，对其保护缺血性损伤的机制的研究也越来越受到人们的关注。在有关其作用机制的实验研究方面，补阳还五汤对缺血脑组织中 Ca2+代谢的影响日益受到关注，有学者研究了补阳还五汤对中风后遗症“气虚血瘀”大鼠模型脑组织中 Ca2+的升高有对抗和治疗作用，对补阳还五汤对 Ca2+的可能影响作了有益的探讨，但尚未见从细胞、基因水平研究本方对 Ca2+影响的报道。如能从细胞、分子、基因水平对本方影响缺血性损伤神经元胞内 Ca2+代谢的机制进行深入研究，将会为揭示该方保护缺血性损伤的机制、指导该方的临床应用产生非常重要的作用。我们的前期研究已经表明：①补阳还五汤预干预可降低全脑缺血再灌注模型大鼠大脑皮层神经元内Ca2+浓度；②可降低全脑缺血再灌注模型大鼠大脑皮层神经元L型Ca2+通道平均开放时间和开放概率。
　　缺氧缺血后神经元和神经胶质细胞内Ca2+失稳态是细胞死亡的最后共同通路。对神经细胞来说，胞内Ca2+主要依赖于胞外Ca2+经细胞膜上的钙通道内流或胞内储存钙的释放。根据通道开启的动因， Ca2+通道主要可分为两大类：电压门控性Ca2+通道(voltage-gated Ca2+ channel,VGCC)和配体门控性Ca2+通道(ligand-gated Ca2+ channel,LGCC)。兴奋性神经递质谷氨酸（glutamate,Glu）已被公认是通过作用于LGCC而发挥作用。Glu受体包括N-甲基-D-天冬氨酸（N- methyl- D– aspartate,NMDA)受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸( alpha- amino-3- hydroxy-5– methyl-4- isoxazolep rop ionic acid,AMPA)、海藻酸( kainate,KA)受体和代谢型受体。
　　AMPA受体作为介导快速兴奋性神经传递的一种重要受体，其在谷氨酸的兴奋毒作用中越来越被人们重视。AMPA受体是由四种不同基因编码的亚基GluR1、GluR2、GluR3、GluR4组成，其中GluR2亚基由于其 mRNAQ/R位点编辑引起的低钙离子通透性，使得它在 AMPA受体中的相对含量决定了AMPA受体的功能特性。GluR2亚基在多种神经元中高表达，这使得钙离子不能通过AMPA受体内流。在多种神经性损伤或退行性疾病中， GluR2表达下调，Ca2+内流增加，引起神经元死亡，此即“GluR2假说”。但这一假说仍处于争议中。例如：GluR2下调并不一定预示着细胞死亡，并且在某些兴奋毒性刺激、缺血或缺血预处理后存活的神经元中存在GluR2的下调。因此GluR2在谷氨酸兴奋毒损伤中的作用仍有待于进一步探讨。
　　NMDA受体由NR1、NR2、NR3、NR4等亚单位组成，NR1为最基本的功能单位，NR2是重要的调节亚单位，有NR2A、NR2B、NR2C、NR2D等4个不同的剪接变体，NR2B是最重要的调节亚单位结构，是脑缺血引起神经元兴奋性损伤的最主要成分。
　　脑缺血／再灌注损伤时NMDA受体各亚单位通过酪氨酸、丝/苏氨酸的磷酸化/去磷酸化发生可逆过程或移位，调节 NMDA受体对神经元的兴奋毒性损伤。最新研究发现，缺血再灌注引起的神经元损伤不仅与 Ca2+内流的量有关，更与 Ca2+内流的途径有关。经NMDA受体通道内流Ca2+与缺血性神经元损伤有密切关系，但其具体机制尚待进一步研究。
　　鉴于Ca2+内流的途径与神经元损伤的关系，因此，本研究从AMPA受体和NMDA受体通道途径出发采用免疫组化技术和 RT-PCR技术，同步研究补阳还五汤预干预对全脑缺血再灌注大鼠皮层神经元GluR2、NR1、NR2B表达的影响。从细胞、分子、基因水平探索补阳还五汤调节钙稳态保护脑缺血再灌注损伤神经元的机制，为临床应用本方预防治疗缺血性脑病提供理论基础和实验依据。
　　方法：
　　实验主要分三个部分：
　　一、补阳还五汤预干预对全脑缺血再灌注大鼠皮层神经元AMPA受体亚单位GluR2表达的影响。
　　实验动物：健康成年SD大鼠，72只，雌雄不限，体重180～220g。
　　实验分组：大鼠随机分为12组：正常组、假手术组、模型组和药物组(后2组各分为缺血再灌注2h、12h、24h、48h、72h等5个时间点共10组)，每组各6只。造模前正常组、假手术组、模型组均用0.9%生理盐水灌胃5d，灌胃容积均量2ml/只，均每天2次；药物组则给予浓度为0.64g/ml的补阳还五汤5d，灌胃容积均量2ml/只，均每天2次。
　　参照改良的Pulsinelii四血管闭塞法制备全脑缺血大鼠模型。
　　免疫组化实验检测
　　二、补阳还五汤预干预对全脑缺血再灌注大鼠皮层神经元NMDA受体亚单位NR1、NR2B表达的影响。
　　实验动物：健康成年SD大鼠，36只，雌雄不限，体重180～220g。
　　实验分组：大鼠随机分为6组：正常组、假手术组、模型组和药物组(后2组各分为缺血再灌注2h、24h，2个时间点共4组)，每组各6只。造模前正常组、假手术组、模型组均用0.9%生理盐水灌胃5d，灌胃容积均量2ml/只，均每天2次；药物组则给予浓度为0.64g/mL的补阳还五汤5d，灌胃容积均量2ml/只，均每天2次。
　　参照改良的Pulsinelii四血管闭塞法制备全脑缺血大鼠模型。
　　免疫组化实验检测
　　三、补阳还五汤预干预对全脑缺血再灌注大鼠皮层神经元NMDA受体亚单位NR1、NR2B mRNA表达的影响。
　　实验动物：健康成年SD大鼠，36只，雌雄不限，体重180～220g。
　　实验分组：大鼠随机分为6组：正常组、假手术组、模型组和药物组(后2组各分为缺血再灌注2h、24h，2个时间点共4组)，每组各6只。造模前正常组、假手术组、模型组均用0.9%生理盐水灌胃5d，灌胃容积均量2ml/只，均每天2次；药物组则给予浓度为0.64g/ml的补阳还五汤5d，灌胃容积均量2ml/只，均每天2次。
　　参照改良的Pulsinelii四血管闭塞法制备全脑缺血大鼠模型。
　　RT-PCR实验检测
　　结果：
　　实验一
　　一、正常组与假手术相比，GluR2的表达没有统计学差异。
　　二、模型组再灌注2h、12h、24h、48h、72h等5个不同时间点，大鼠皮层神经元GluR2的表达量明显低于正常组/假手术组，但模型组5个不同时点之间GluR2的表达量没有统计学差异。
　　三、经补阳还五汤预干预的全脑缺血大鼠，再灌注2h、12h、24h、48h、72h等5个不同时间点，皮层神经元 GluR2表达的改变虽显著低于正常组/假手术组，但与模型组各时点相比，药物组GluR2表达明显偏高，表明补阳还五汤预干预对全脑缺血再灌注模型大鼠皮层神经元GlR2表达量的降低有一定的抑制作用，尤其在12h、24h、48h、72h各时点增高的更多，且各与2h相比都有统计学差异，表明补阳还五汤预干预对全脑缺血再灌注模型大鼠皮层神经元 GluR2表达的影响在缺血不同阶段有所不同。
　　实验二
　　一、正常组与假手术相比，NR1、NR2B的表达没有统计学差异。
　　二、模型组缺血再灌注2h、24h，2个不同时间点，大鼠皮层神经元NR1、NR2B的表达量均明显高于正常组/假手术组，差异有统计学意义。
　　三、经补阳还五汤预干预的全脑缺血大鼠，再灌注2h、24h，2个不同时间点，皮层神经元NR1、NR2B表达量，与模型组各时点相比明显偏低，显示补阳还五汤预干预对全脑缺血再灌注模型大鼠皮层神经元NR1、NR2B升高有一定的抑制作用。
　　实验三
　　一、正常组与假手术组比较，皮层神经元NR1、NR2B在mRNA水平的表达都没有统计学差异。
　　二、模型组2h、24h不同时点皮层神经元NR1、NR2B的表达在mRNA水平均比正常组/假手术组要高，且有统计学差异。
　　三、药物组2h、24h不同时点皮层神经元 NR1、NR2B的表达在mRNA水平也均比正常组/假手术组高，但与模型组相比，各时点的表达量均降低，且有统计学意义。显示补阳还五汤预干预对全脑缺血再灌注模型大鼠皮层神经元NR1、NR2B mRNA升高有一定的抑制作用。
　　结论：
　　基于本论文研究结果，结合前期研究工作，我们认为：
　　①GluR2、NR1、NR2B在大鼠全脑缺血再灌注引起的神经元钙超载中发挥一定作用。
　　②GluR2表达的减少，NR1、NR2B表达的增高和L型钙离子通道的开放发挥协同作用，共同介导胞外钙离子内流，引起胞内钙超载，导致神经元损伤。
　　③本研究中补阳还五汤的预干预可以抑制全脑缺血再灌注皮层神经元GluR2量的减少和NR1、NR2B量的增多。

目录

声明

引 言

第一章 背景研究

第一节 脑缺血再灌注损伤的机制研究进展

一、血脑屏障(blood brain barrier,BBB)

二、兴奋性氨基酸

三、Ca2+超载的细胞毒作用

四、炎症

五、基因表达

第二节 补阳还五汤防治脑出血再灌注损伤的机制研究进展

一、对兴奋性氨基酸的影响

二、对细胞内Ca2+的影响

三、对IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、TNF-α的影响

四、对细胞凋亡、线粒体、Bcl-2/Bax的影响

五、对星形胶质细胞（AS）、热休克蛋白70的影响

六、对caspase表达作用的影响

七、NO，NOS

八、MDA、SOD

九、对血脑屏障的影响

十、总结

第三节 前期工作

第二章 实验研究

第一节 补阳还五汤对全脑缺血再灌注模型大鼠皮层神经元GluR2表达的影响

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第二节 补阳还五汤对全脑缺血再灌注后大鼠皮层神经元NR1与NR2B表达的影响

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第三节 补阳还五汤对全脑缺血再灌注大鼠皮层神经元NR1与NR2B mRNA表达的影响

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

结 语

一、研究结论

二、创新点

三、存在的问题

参考文献

附 录

附录 1：实验图片

附录 2：英文缩略语

附录 3：模型成功参照标准

在校期间发表论文情况

致谢