续断及其有效部位补肾安胎的药效学研究

摘要

目的：
　　续断是寿胎丸主要组成药物之一，本研究旨在研究续断及其续断主要活性成分续断总生物碱和总苷对肾虚-黄体功能抑制病-证结合流产模型的治疗作用，探讨其调节内分泌、促进滋养细胞的增殖能力等机制,为寿胎丸防治自然流产的药效物质基础研究打基础。
　　方法：
　　实验一：整体动物模型的药效学研究
　　实验药物的制备和鉴定：根据前期研究结果，减味寿胎丸采用菟丝子、桑寄生、续断三味药组成的新复方。购置上述地道药材并行生药鉴定。制备减味寿胎丸水提加醇提液、续断水提物、提取续断活性成分续断总生物碱和续断总苷，并以薄层色谱法和高效液相色谱(HPLC-UV指纹图谱)法与标准品对照进行成分的鉴定和质量的控制。
　　分组与给药：将孕鼠按完全随机法分为13个组，分别为正常对照组、模型组、地屈孕酮组、减味寿胎丸总提物组、续断总提物组（高、中、低剂量组）、续断总皂苷组（高、中、低剂量组）、续断总生物碱组（高、中、低剂量组），每组10只。
　　肾虚-黄体功能抑制病-证结合流产模型的制备：除正常对照组外，其余各组妊娠大鼠从第1日至第10日每日羟基脲溶液450mg/kg剂量灌胃，每天5ml/kg，1次/天，；第10天下午3时加灌米非司酮溶液(RU486)3.75mg/kg。正常对照组均给予等量的生理盐水。
　　主要检测指标：一般情况指标、内分泌指标(米非司酮给药20h后眼眶静脉/腹主动脉取血以电化学发光法检测雌二醇、孕酮；以qRT-PCR方法检测子宫及卵巢组织雌、孕激素受体的表达)、阴道出血及子宫瘀血情况、单侧子宫及胚胎重量、总胎数、活胎数、流产数，流产率。
　　实验二：细胞模型的建立和续断有效部位对滋养细胞作用的研究
　　采集正常妊娠6-8周健康孕妇人流手术的绒毛膜组织。分离滋养细胞并在一定条件下培养，扫描电镜观察及台盼蓝排斥试验细胞存活率达90%则说明培养成功。用0.25%胰蛋白酶消化传代，将细胞按1×105密度种植于培养瓶或培养板中。待细胞贴壁生长时，进行免疫组化法细胞鉴定：确定为绒毛膜滋养层细胞方可用于实验。
　　分组：共分为8组，空白对照组（生理盐水组）、减味寿胎丸总提物组（寿全）、续断总提物高、低剂量组（XDG、XDD）、续断皂苷高、低剂量组（XZG、XZD）、续断生物碱高、低剂量组（XSG、XSD），每组设3个复孔。
　　含药血清的制备和干预：每组6只,给药2次/天,连续3d,末次给药前禁食不禁水12 h,末次给药1 h后采血,常规制备药物血清。使用滋养层细胞培养基(TM)配制5%、10%、20%含药血清。将细胞接种于12孔板中，待细胞长满80%左右时去除培养基，加入不含血清的培养液培养24h。去除培养液，各孔分别加入100μl对应含药血清，再加入900μl不含血清的培养液孵育。
　　指标检测：MTT比色法分析含药血清干预后滋养细胞增殖活力及以FCM分析滋养细胞早期凋亡。
　　结果：
　　模型组与正常对照组比较单侧子宫及单个胚胎湿重较正常组显著降低、阴道出血及子宫瘀血显著增加，流产率显著提高，E2、P、ER、PR均显著降低。
　　模型组与正常对照组比较流产率显著增加，差异有极统计学意义(P<0.01)，地屈孕酮组、续断总中组、续断总苷中组、续断碱低组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。续断总中组、续断总苷中组、续断碱低组与模型组比较流产率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。续断总高组、续断总低组与正常对照组比较流产率增加，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　各组血清E2水平：续总高组、续总中组与正常对照组比较的差别无统计学意义(P>0.05)，续总高组、续总中组与模型组比较，E2增高，差别有统计学意义(P<0.05)。其余各组与模型组比较E2差别无统计学意义(P>0.05)，且低于正常对照组(P<0.05)。
　　各治疗组血清孕酮水平与正常对照组比较，差别有统计学意义(P<0.01)。各治疗组与模型组比较，差别无统计学意义(P>0.05)。
　　续总中组、续总苷中组与正常对照组及与模型组比较，子宫蜕膜PR mRNA、ER mRNA表达显著增加，差别都有统计学意义(P<0.05，或P<0.01)
　　减味寿胎丸组与空白对照组比较，细胞吸收度值增加，差别有统计学意义(P<0.05)，5%、10%、20%含药血清的细胞吸收度值差别有极显著统计学意义（P<0.05），随着浓度增加而增加。续断总提物高剂量组及续断总苷高剂量组10%、20%含药血清与空白对照组比较，细胞吸收度值增高，差别有统计学意义（P<0.05），其余各组差异无统计学意义。续断总提物高剂量组及续断总苷高剂量组20%含药血清与减味寿胎丸组比较,细胞吸收度值差别无统计学意义（P＞0.05），其余各组10%、20%血清与减味寿胎丸组比较,细胞吸收度值降低，有统计学意义(P<0.01)。续断总提物高剂量组、低剂量组、及续断总苷高剂量组与空白对照组比较，24h、48h细胞周期分布S期细胞百分比增多，G2/M期细胞下降，差别有统计学意义（P<0.01），G1/G0变化不大（P＞0.05）。续断总提物、总苷、总生物碱各组与减味寿胎丸组比较, S期细胞百分比减少，G2/M期细胞增多，差别有统计学意义（P<0.01），G1/G0变化不大（P＞0.05）。
　　结论：
　　1病-证结合流产模型的符合肾虚和黄体不健的临床表现特征。
　　2续断总提物中剂量组、续断总苷中剂量组、续断总生物碱低剂量组能有效降低肾虚-黄体抑制大鼠流产率，减少阴道流血。其机制可能是多靶点的：续断总提物能够提高血清雌激素水平、促进子宫、卵巢雌、孕激素受体的表达；续断总苷能够促进雌、孕激素受体的表达，续断总生物碱的作用可能与降低子宫平滑肌兴奋性有关，而与调整内分泌的关系不大。
　　3减味寿胎丸组对人滋养细胞增殖有明显促进作用，且具有量效相关性，续断及各成分组对人滋养细胞增殖的促进作用明显低于减味寿胎丸组。续断总提物高剂量组及续断总苷高剂量组对人滋养细胞增殖有促进作用，20%含药血清与减味寿胎丸促进作用相似，48h的细胞周期变化较24h更加明显。其余各组并不能对人滋养细胞增殖起明显促进作用。

目录

声明

引言

第一章 文献研究

第1节 自然流产的中医研究概况

1 中西医对自然流产的病因病机研究概况

2 自然流产证型分布规律研究进展

3 自然流产治法方药的研究概况

4 中药安胎作用机理的研究

5 安胎中药安全性的研究概况

第2节 寿胎丸治疗自然流产的研究进展

1 抑制子宫平滑肌收缩

2 对免疫的调节

3 对内分泌的调节

4 药效物质基础及组方配比及优化的研究

5 寿胎丸的遗传安全性的系列研究

第3节 续断研究概况

1 续断药用植物资源

2 不同产地续断的质量比较

3 炮制方法对续断理化性质及功效的影响

4 续断药材的鉴别和质量控制

5 续断药理作用的研究

6 续断化学成分的研究

7 续断有效成分的提取工艺研究

8 续断在妇科的临床应用及研究概况

第二章 实验研究

第1节 立论依据

第2节 研究方法(技术路线)

第3节 续断及续断主要活性成分（总生物碱、总苷）对肾虚-黄体功能抑制流产模型大鼠安胎作用的药效及部分作用机制研究

1 实验目的

2 实验材料

3 实验方法

5 实验结果

6 讨论

7 结论

第4节 减味寿胎丸复方及续断不同提取成分含药血清对人早孕滋养细胞模型的影响的实验研究

1 实验目的

2 实验仪器及主要试剂

3 实验方法

4 指标检测

5 结果

6 讨论

结语

1结论

2主要创新点

3不足之处

4展望

参考文献

附录

致谢