中药基于分子伴侣机制逆转EGFR-TKI耐药及中医药治疗NSCLC的meta分析

摘要

世界卫生组织国际癌症研究中心日前公布的研究报告指出到2020年全世界恶性肿瘤发病率将增加50%，全球每年新增恶性肿瘤患者人数将达到1500万人。根据该中心的这份研究报告，目前全世界发病率最高的恶性肿瘤是肺癌，每年新增患者人数为120万。[1]-[2]其中非小细胞肺癌占到所有肺癌病例中的80%-85%，包括鳞癌、腺癌、鳞腺癌或腺鳞癌、大细胞癌，小细胞肺癌仅占10%-15%。肺癌在严重威胁着人类的健康和生命，与此同时，人们也一直在寻求积极有效的防治肺癌的手段，化疗一度是治疗非小细胞肺癌的主要手段，但其强烈的毒副反应及局限的疗效使得人们不得不寻求更为有效的治疗方法，21世纪以来，分子靶向药物的出现，尤其是表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）的临床应用使非小细胞肺癌的治疗取得突破性的进展，然而耐药性的产生使非小细胞肺癌的治疗再次陷入迷途，而目前耐药性产生的机制尚未明确，亦缺乏有效的应对策略，因此探索 EGFR-TKI的耐药机制及寻求有效的应对策略对肺癌的治疗及未来靶向药物的研发具有极其重要的意义。在西医治疗非小细胞肺癌的手段不断发展和突破的同时，中医药在治疗非小细胞肺癌领域也开始崭露头角，在“十五”重点攻关计划和“十一五”科技支撑计划的研究基础上，我们验证了益气除痰方治疗中晚期肺癌能稳定瘤体，延长生存期，并通过基础实验研究发现益气除痰方的抗癌机制与内质网应激反应分子伴侣蛋白表达相关，而内质网应激反应中分子伴侣蛋白表达与肿瘤细胞的耐药密切相关。中医药治疗非小细胞肺癌有一定的疗效，但目前缺乏高级别的循证医学证据，因此在临床中不被医生广泛认可和接受，限制了中医药在临床的进一步推广使用。本课题一方面通过 meta分析方法评价中医药治疗非小细胞肺癌的临床研究文献以期获得中医药治疗非小细胞肺癌的高级别循证医学证据，在确定中医药的疗效的基础上通过基础实验研究中医药逆转 EGFR-TKI耐药的机制，对进一步探索 EGFR-TKI耐药机制及寻找应对策略有着积极的意义，同时能丰富中医药的抗癌理论，为中医药临床治疗非小细胞肺癌提供循证医学证据和理论基础。
　　目的：
　　本课题通过对中医药治疗非小细胞肺癌疗效的临床研究文献进行meta分析，并在此基础上通过实验研究中药基于内质网应激反应分子伴侣机制逆转EGFR-TKI耐药，从基础实验和临床研究总结两方面进行探讨，旨在为治疗非小细胞肺癌提供临床综合治疗策略，同时为中医药在非小细胞肺癌中临床应用及基础研究提供思路。
　　方法：
　　一、Meta分析方法分析中医药治疗非小细胞肺癌临床研究文献
　　通过数据库检索2002-2012年期间中医药治疗非小细胞肺癌的临床研究文献，按照文献纳入标准、排除标准筛选文献，从随机、随机隐匿、盲法实施、删失病例等方面进行统计分析，并根据Cochrane系统的Jadad量表为文献质量评分，在此基础上利用RevMan4.2软件进行meta分析绘制森林图，进行敏感性分析，绘制漏斗图对发表性偏倚进行分析，最后对结果进行分析、讨论。
　　二、实验研究中药基于分子伴侣机制逆转EGFR-TKI耐药
　　1、MTT比色法测中药对肺腺癌细胞A549细胞和厄洛替尼耐药肺癌细胞H1650的增殖抑制的影响
　　内质网应激保护反应受损，益气除痰方能否抑制内质网应激反应对细胞的保护作用，诱导细胞凋亡，中药处理各组细胞后，采用MTT法检测药物对细胞抑制率的影响。
　　2、厄洛替尼对A549细胞和H1650细胞的半数抑制率IC50测定。
　　分别用不同浓度的厄洛替尼作用于两种细胞，MTT比色法测出不同浓度下厄洛替尼对细胞抑制率，并计算出厄洛替尼的半数抑制浓度IC50.
　　3、中药对肺癌分子靶向治疗逆转耐药的作用
　　如果中药对耐药肺癌细胞具有诱导凋亡作用，是否因此增强分子靶向治疗疗效或逆转肺癌耐药，在耐药细胞组中加用厄洛替尼和中药联合组，测中药作用下，厄洛替尼对A549和H1650的IC50，计算中药对厄洛替尼的逆转倍数。
　　4、western-blot分析中药对耐药肺癌内质网分子伴侣的影响
　　分子伴侣蛋白的表达对错配蛋白的修复，是内质网应激反应中的重要环节，也是肿瘤细胞耐药的重要机制。以中药作用A549细胞和H1650细胞后，以 western blot方法检测分子伴侣CHOP、GRP78/BIP、GADD34的蛋白表达，根据结果分析分子伴侣蛋白与肿瘤细胞耐药的关系，并分析中药对分子伴侣蛋白表达水平的影响。
　　结果：
　　1、中医药治疗NSCLC的meta分析
　　根据纳入标准和排除标准筛选文献，最终共纳入符合文献14篇。纳入文献中共累计病例1194例，根据修改后的Jadad量表评分（1-3分视为低质量，4-7分视为高质量），其中2篇为4分，5篇为3分，1篇2分，7篇1分。纳入文献研究间的效应量是同质的，治疗组与对照组疾病控制率的OR（比值比）值为1.69，95%可信区间CI=[1.20，2.20]，P<0.0001。进行敏感性分析剔除2篇质量较差文献后重新分析支持该结果，且发表性偏倚不大。
　　2、MTT比色法测厄洛替尼、中药及联合组对A549及H1650细胞抑制率
　　中药组、厄洛替尼组、联合组分别作用于A549细胞和H1650细胞，均能抑制细胞增殖，并且随着药物浓度的增高，抑制率增加。（P<0.05）；厄洛替尼对A549细胞半数抑制浓度IC50为：7.0μg/ml，对H1650细胞的半数抑制浓度IC50为：47.5μg/ml。两者联合作用于A549细胞能增强厄洛替尼的细胞抑制率，与单独厄洛替尼组相比P<0.05.同样中药联合不同浓度厄洛替尼作用于H1650细胞能增强厄洛替尼的细胞抑制率，与单独厄洛替尼组相比P<0.05。联合作用下，厄洛替尼对A549细胞半数抑制浓度IC50为：1.9μg/ml，单用是合用的3.68倍，逆转倍数为3.68。中药联合作用下，厄洛替尼对H1650细胞的半数抑制浓度IC50为：2.53μg/ml，单用是合用的18.7倍，逆转倍数18.7。
　　3、western-blot测分子伴侣CHOP、GRP78/BIP、GADD34的蛋白表达。
　　H1650细胞中CHOP、GRP78/BIP、GADD34蛋白表达水平均高于A549细胞，中药能下调H1650细胞内质网应激反应分子伴侣蛋白CHOP、GRP78、GADD34的表达，厄洛替尼组的H1650细胞中CHOP表达量1.31，联合组CHOP表达量0.91，均高于A549细胞中CHOP表达量0.89。厄洛替尼组的H1650细胞中GRP78表达量0.91，联合组GRP78表达量0.78，均高于 A549细胞中 GRP78表达量0.63。厄洛替尼组的H1650细胞中GADD34表达量0.86，联合组GADD34表达量0.70，均高于A549细胞中GADD34表达量0.43。
　　结论：
　　通过对中医药治疗非小细胞肺癌的临床研究文献进行meta分析结果显示中医药治疗非小细胞肺癌在疾病控制率上稍优于化疗组（P<0.0001），显示出了一定的疗效，尤其体现在瘤体的稳定率方面，与此同时也发现中医药治疗非小细胞肺癌的临床研究普遍质量较差，存在研究设计不规范等诸多问题，这是今后中医药临床研究需要努力的方向。
　　中药和厄洛替尼均能抑制A549细胞和H1650细胞的增殖，联合作用下中药能逆转H1650细胞对厄洛替尼的耐药性，内质网应激反应中分子伴侣蛋白高表达可能是肿瘤细胞对厄洛替尼耐药的重要机制，而中药能通过下调分子伴侣蛋白表达抑制内质网应激反应从而逆转厄洛替尼耐药，增强H1650细胞对厄洛替尼的敏感性。
　　本研究通过对中医药治疗非小细胞肺癌临床研究的meta分析以及对中药抑制EGFR-TKI耐药的体外细胞研究得出结论，中医药治疗非小细胞肺癌具有一定的疗效，尤其是稳定瘤体方面，同时，基础研究发现内质网应激反应中分子伴侣蛋白表达可能是肿瘤细胞EGFR-TKI耐药的机制之一，而中药联合EGFR-TKI治疗非小细胞肺癌能逆转EGFR-TKI耐药，提高EGFR-TKI疗效，进一步的研究有赖于在临床中进行大型随机对照试验验证。

目录

声明

引言

第一章 文献研究

1.1 中医药治疗NSCLC的研究

1.2 中医药逆转肿瘤耐药相关研究

1.3 TKI药物的耐药机制相关研究

1.4 内质网UPR与肿瘤的关系

1.5 小结

第二章 中医药治疗NSCLC的meta分析

2.1 研究材料：

2.2 研究方法

2.3 结果

2.4 结果分析及讨论

2.5结论

第三章 中药抑制TKI耐药实验研究

3.1 研究材料

3.2 研究方法

3.3 实验结果

3.4结果分析及讨论

3.5结论

第四章 总结及展望

4.1 本课题研究的意义和创新之处

4.2 本课题研究存在的问题

4.3 展望

附录一：Jadad量表

附录二：中药联合EGFR-TKI治疗NSCLC验案二则

参考文献

致谢