基于NF-κB通路研究健脾化瘀解毒法治疗胃癌前病变的作用机制

摘要

背景：胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，具有较高的发病率，据估计，世界范围内最常见的恶性肿瘤中，胃癌排第四，在我国大中城市中胃癌居男性恶性肿瘤发病的第二位，死亡率则居恶性肿瘤的第一位。大量的流行病学研究显示慢性萎缩性胃炎(CAG)与胃癌的发生有关，CAG被认为是一种癌前疾病， CAG基础上伴有的肠上皮化生和不典型增生则是胃癌的癌前病变（PLGC）。阻断及改善具有潜在恶性变的癌前病变，对降低胃癌的发病率，防治胃癌具有重要的意义，因此开发研究阻断及改善胃癌前病变的相关药物，显得极其紧迫而且必要。
　　前期的工作表明：健脾化瘀解毒法不仅可以明显改善CAG患者的临床症状，而且可以改善及阻断癌前病变进一步发展，健脾化瘀解毒法各剂量组可通过促进 p53和Bax表达，同时抑制Bcl-2表达，阻止PLGC胃黏膜上皮细胞从G0/G1期进入S期，并通过诱导凋亡，抑制胃癌前病变不典型增生基础上的癌性恶变，但其具体作用机制还不明确。
　　目的：
　　1、观察健脾化瘀解毒法对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织病理学及上皮细胞超微结构的影响。
　　2、观察健脾化瘀解毒法对胃癌前病变大鼠胃黏膜κB抑制蛋白激酶β（IKKβ）、核转录因子（NF-κB）p65信使核糖核酸（mRNA）表达的影响。
　　3、观察健脾化瘀解毒法对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织细胞周期蛋白E(Cyclin E)表达的影响。
　　方法：
　　1、实验造模、分组、给药。采用随机数字表法，将SD大鼠随机分为正常组15只，模型组115只。正常组大鼠常规喂养。模型组大鼠每日自由饮用167 mg/L1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍((MNNG)溶液，同时下午灌胃167 mg/L浓度的MNNG溶液，每只每天灌液1 mL；造模期间每进食2 d，再禁食1 d，并在禁食当天下午用40%酒精按每只2 mL灌胃攻击。连续16周，16周末时随机取造模大鼠10只，通过光镜下观察确认造模成功。以光镜下出现萎缩伴不典型增生为造模成功。造模成功后，采用随机数字表法，将剩余模型组大鼠随机分为模型对照组（25只）、维酶素组（20只）、健脾化瘀解毒法低剂量组（20只）、健脾化瘀解毒法中剂量组（20只）、健脾化瘀解毒法高剂量组（20只）。
　　实验第17周开始，正常对照组灌胃生理盐水，2 mL/只.d-1；健脾化瘀解毒法低剂量组按3.75 g/kg.d-1(0.5倍成人临床等效量)灌胃2 mL/只.d-1，健脾化瘀解毒法中剂量组按7.5 g/kg·d-1(1倍成人临床等效量)灌胃2 mL/只.d-1，健脾化瘀解毒法高剂量组按15 g/kg.d-1(2倍成人临床等效量)灌胃2 mL/只.d-1。维酶素组按0.2 g/kg.d-1(1倍成人临床等效量)灌胃2 mL/只.d-1。灌胃共4周。于第20周末，禁食禁水12 h后取样。
　　2、取材：脱颈椎处死动物后，剖腹取胃，沿胃大弯侧剪开，用生理盐水冲洗胃腔后，以胃小弯为中心，从前胃至胃窦剪取全胃壁组织，用于病理检测、制备透视电镜观察样品及免疫组化检测。留取部分胃黏膜立即置于-70℃低温冰箱中保存。
　　3、指标检测：常规观察大鼠一般情况及大鼠胃黏膜组织，电镜下观察胃黏膜上皮细胞超微结构。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测IKKβ、NF-κB/p65 mRNA表达。免疫组化法检测Cyclin E表达。
　　结果：
　　1、各组大鼠胃黏膜组织病理学及上皮细胞超微结构的改变：正常组大鼠皮毛光泽，精神可，灵活喜动，饮食正常；模型组大鼠皮毛凌乱且光泽度差，精神萎靡不振，懒动；维酶素治疗组和健脾化瘀解毒法治疗组大鼠均有不同程度皮毛欠光泽、精神欠佳、活动及饮食减少；与正常组相比较，健脾化瘀解毒法治疗组和维酶素组大鼠状态（皮毛光泽度、精神状态等）较差，而与模型组比较则大鼠状态较强。实验过程中，正常组死亡3只，模型对照组、维霉素组、健脾化瘀解毒法低剂量组、健脾化瘀解毒法中剂量组和健脾化瘀解毒法高剂量组大鼠死亡数目分别为8只、7只、6只、5只、5只。
　　在OLYM PUS-BX60常规光学显微镜下观察：正常对照组大鼠胃黏膜上皮完整，上皮细胞排列整齐，无脱落或缺损，腺体形态规则，固有层未见炎细胞浸润，黏膜肌层完整；模型对照组大鼠胃黏膜不完整，呈灰白色，光镜下观察可见不同程度的变性或坏死的脱落细胞，黏膜层变薄，黏膜皱襞变平或走向紊乱且胃黏膜呈多灶性萎缩，腺体排列紊乱，部分腺体呈囊状扩张，上皮细胞形态大小不一，核浆比例增大，黏膜肌层向黏膜层延伸，间质水肿、充血、炎细胞浸润。胃组织受浸润的炎细胞主要是淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和少量单核细胞，在部分区域黏膜出现肠上皮化生，化生的肠上皮细胞核大、深染，核呈空泡状，可见杯状细胞；维霉素组大鼠胃黏膜呈粉红色，光泽度差，胃黏膜变薄、皱襞紊乱，偶见炎细胞浸润。间质水肿、充血、炎细胞浸润，部分区域黏膜可见肠上皮化生；健脾化瘀解毒法低剂量组大鼠胃黏膜呈粉红色，光泽度差，胃黏膜变薄、皱襞紊乱。偶见间质水肿、充血，可见中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润。部分区域可见肠上皮化生；健脾化瘀解毒法中剂量组大鼠胃粘膜呈粉红色，光泽度欠佳，胃黏膜变薄、皱襞较紊乱。偶见间质水肿、充血，可见中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润。部分区域可见肠上皮化生；健脾化瘀解毒法高剂量组大鼠胃粘膜呈粉红色，光泽度欠佳。腺体排列相对较整齐，腺体形态尚规则。偶见间质水肿、充血，可见少量中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润。
　　各组大鼠胃黏膜胃黏膜组织上皮细胞超微结构的观察：正常组细胞核呈圆形或椭圆形，细胞器形态正常，细胞质密度高；模型组细胞核呈不规则形，核大深染，核质比例增大，细胞器显著减少，胞质出现裂隙，细胞间联系不发达；维酶素组细胞核呈类椭圆形，细胞器减少，胞质出现裂隙；健脾化瘀解毒法组细胞核呈类椭圆形，细胞器形态正常，细胞质密度高。
　　证明健脾化瘀解毒法可改善PLGC大鼠一般情况及改善胃黏膜组织病理学的表现，可维持细胞核正常形态结构、对 PLGC大鼠胃黏膜上皮细胞超微结构有所改善，提示健脾化瘀解毒法对PLGC大鼠有较好的治疗效果。
　　2、各组大鼠胃黏膜组织IKKβ、NF-κB/p65 mRNA的表达：模型对照组IKKβ的表达增强，与正常对照组相比差异有统计学意义。维酶素组IKKβ的表达降低，与模型对照组相比差异有统计学意义。健脾化瘀解毒法高剂量组、健脾化瘀解毒法中级量组、健脾化瘀解毒法低剂量组的IKKβ表达降低，与模型对照组相比差异有统计学意义。健脾化瘀解毒法可降低IKKβ的表达，其中健脾化瘀解毒法高剂量组疗效最为显著。
　　模型对照组 NF-κB/p65mRNA的表达增强，与正常对照组相比差异有统计学意义。维酶素组的NF-κB/p65mRNA的表达降低，与模型对照组相比差异有统计学意义。健脾化瘀解毒法高剂量组、健脾化瘀解毒法中级量组、健脾化瘀解毒法低剂量组的NF-κB/p65mRNA的表达降低，与模型对照组相比差异有统计学意义。健脾化瘀解毒法可降低 NF-κB/p65mRNA的表达,其中健脾化瘀解毒法高剂量组疗效最为显著。
　　3、各组大鼠胃黏膜组织Cyclin E蛋白的表达：模型对照组 Cyclin E的表达增强，与正常对照组相比差异有统计学意义。维酶素组 Cyclin E的表达降低，与模型对照组相比差异有统计学意义。健脾化瘀解毒法高剂量组、健脾化瘀解毒法中级量组、健脾化瘀解毒法低剂量组的Cyclin E的表达降低，与模型对照组相比差异有统计学意义。健脾化瘀解毒法可降低Cyclin E的表达，证明健脾化瘀解毒法可以从NF-κB通路的下游起到调节作用，通过降低 Cyclin E的表达，抑制细胞发生异常增殖，说明健脾化瘀解毒法对PLGC的治疗机制可能与降低Cyclin E蛋白的表达有关。
　　结论：健脾化瘀解毒法可改善 PLGC大鼠的一般情况，可明显改善胃癌前病变大鼠胃黏膜组织的病理表现，可维持细胞核正常形态结构、改善 PLGC大鼠细胞的超微结构；健脾化瘀解毒法可降低大鼠胃黏膜 IKKβ、NF-κB/p65 mRNA的表达；健脾化瘀解毒法可降低胃黏膜组织 Cyclin E的表达；健脾化瘀解毒法可明显改善大鼠胃黏膜上皮细胞的超微结构。证明健脾化瘀解毒法对 PLGC大鼠有较好的治疗效果，其机制可能与降低NF-κB/p65、IKKβ及Cyclin E蛋白的表达有关。

目录

声明

引言

第一章 文献研究

1.1 中医药防治胃癌前病变研究进展

1.1.1 病名研究

1.1.2 病因病机研究

1.1.3 中医现代文献对胃癌前病变的临床研究

1.1.4 中医现代文献对胃癌前病变的实验研究

1.1.5 存在的问题及展望

2.1 现代医学防治胃癌前病变研究进展

2.1.1 胃癌前病变与胃癌

2.1.2 胃癌前病变的病因和发病机制

2.1.3 胃癌前病变的诊断

2.1.4 胃癌前病变的治疗

2.1.5 存在的问题及展望

3.1 胃癌及胃癌前病变中NF-κB信号通路的研究进展

3.1.1 NF-κB通路的组成和结构

3.1.2 NF-κB的激活机制

3.1.3 NF-κB的功能

3.1.4 NF-κB与胃癌的发生

4.1 Cyclin E与肿瘤发生关系的研究进展

4.1.1 Cyclin E 的结构与功能

4.1.2 Cyclin E与CDK2在细胞周期中的作用

4.1.3 Cyclin E与肿瘤发生的关系

5.1 小结

第二章 实验研究

1.1 健脾化瘀解毒法对PLGC大鼠胃黏膜组织病理学及上皮细胞超微结构的影响

1.1.1 材料与方法

1.1.2 结果

1.1.3 讨论

2.1.1 材料与方法

2.1.2 结果

2.1.3 讨论

3.1 健脾化瘀解毒法对PLGC大鼠胃黏膜组织Cyclin E表达的影响

3.1.1 材料与方法

3.1.2 结果

3.1.3 讨论

结语

1.1 研究结论

1.1.1 PLGC大鼠一般情况与常规病理检测

1.1.2 健脾化瘀解毒法对PLGC大鼠胃黏膜IKKβ、NF-κB/p65 mRNA表达的影响

1.1.3 健脾化瘀解毒法对PLGC大鼠胃黏膜组织Cyclin E表达的影响

2.1 研究的创新性

2.1.1 研究思路上具有创新性

2.1.2 在研究指标上具有创新性

2.1.3 在造模方法上具有创新性

3.1 问题与展望

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢