荔枝核改善2型糖尿病胰岛素抵抗作用及机制的研究

摘要

目的: 胰岛素抵抗是2型糖尿病主要的病理机制之一。本论文以荔枝核提取物为研究对象，围绕胰岛素抵抗，采用高脂饮食加链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠动物模型、3T3-L1脂肪细胞模型，运用药理学和细胞生物学的研究方法，探讨荔枝核提取物（即荔枝核有效部位群，含总皂苷、黄酮和鞣质）改善胰岛素抵抗的作用及机制。 方法: 实验一:荔枝核提取物改善高脂饮食加链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗作用及机制研究 1.高脂饲料饲养SD大鼠8周，然后腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ，30mg/kg)，在两者共同作用下建立理想的胰岛素抵抗(IR)2型糖尿病大鼠模型。 2.观察荔枝核提取物对2型糖尿病大鼠空腹血糖的影响。 3.糖尿病大鼠连续给药4周后，用口服糖耐量实验(OGTT)法，观察荔枝核提取物对糖尿病大鼠糖耐量损伤的影响。 4.连续给药4周后，检测荔枝核提取物高、低剂量组治疗后对糖尿病大鼠FINS、ISI、HOMA-IR、HBCI、TG、HDL-C、LDL-C、ALT和TP等水平的改变，观察药物对胰腺组织GRP78 mRNA和CHOP mRNA表达的影响。 实验二:荔枝核提取物改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗作用及机制研究 1.采用3T3-L1前脂肪细胞在完全培养基(高糖DMEM培养基中添加体积分数10％FBS)于37℃、体积分数5％CO2条件下培养，取对数生长的细胞，以5×104/mL的密度接种于96孔培养板中，细胞完全融合后，接触抑制48h后，加入分化诱导剂Ⅰ(0.5mmol/L IBMX、1umol/L DE、10mg/L insulin)，作用48h后，再采用分化诱导剂Ⅱ（10mg/L insulin），将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成成熟的脂肪细胞（分化成熟的脂肪细胞采用油红O染色的方法进行鉴定）。 2.将分化成熟的脂肪细胞分为5组，即空白对照组、荔枝核提取物高剂量组(0.4mg/mL)、荔枝核提取物低剂量组(0.2mg/mL)、罗格列酮(1×10-5mol/L)组及IR模型组，每组7个复孔。除细胞对照组外，其余各组细胞均以地塞米松(1×10-6 mol/L)诱导细胞IR，48h后各给药组加入受试药物，细胞对照组与模型组改为普通培养液，药物作用48h后，取上清液，用葡萄糖氧化酶法测定上清液中的葡萄糖含量。 3.药物作用细胞48h后，以空白对照组和罗格列酮组分别作为阴性和阳性对照组，采用Real-time PCR检测各组细胞RETN mRNA、PTP1B mRNA和GRP78 mRNA表达水平。 结果: 实验一:荔枝核提取物改善高脂饮食加链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗作用及机制研究 1.高脂饲料加小剂量腹腔注射STZ联合诱导，成功建立胰岛素抵抗动物模型。 2.荔枝核提取物高剂量组(1.87g/kg)及低剂量组(0.47g/kg)可在一定程度上降低糖尿病大鼠空腹血糖;高剂量组与模型组比较，差异具有显著性意义(P＜0.01)。 3.荔枝核提取物高、低剂量组能降低糖尿病大鼠口服糖耐量各个时间点的血糖值，高剂量组与模型组比较，差异具有显著性意义(P＜0.05)，提示荔枝核提取物对糖尿病大鼠糖耐量的损伤有修复作用。 4.荔枝核提取物高、低剂量组能够显著提高糖尿病大鼠胰岛素敏感指数ISI，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05）;并可明显降低稳态胰岛素抵抗指数HOMA-IR，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。提示荔枝核提取物通过增加胰岛素敏感性和提高胰岛β细胞功能而改善2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。 5.荔枝核提取物高剂量组可显著降低2型糖尿病大鼠血清TG水平，与模型组比较差异有显著性差异(P＜0.05)，提示荔枝核提取物有调节脂代谢的作用。 6.荔枝核提取物高、低剂量组能够显著降低糖尿病大鼠血清中ALT水平，并提高TP水平，与模型组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)，提示荔枝核提取物能改善糖尿病大鼠的肝功能。 7.荔枝核提取物高、低剂量组可以改善大鼠胰腺组织，尤其是胰岛的病理损伤，并促进内质网、线粒体等损伤细胞器的修复。 8.荔枝核提取物高、低剂量组能够显著降低糖尿病大鼠胰腺组织GRP78 mRNA表达水平，与模型组比较，差异具有著性意义(P＜0.001);高剂量组能显著降低CHOP mRNA表达水平，与模型组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)，提示荔枝核提取物改善胰岛素抵抗机制可能与抑制GRP78、CHOP基因的mRNA表达有关。 实验二:荔枝核提取物改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗作用及机制研究 1.3T3-L1前脂肪细胞的培养、诱导分化和鉴定实验:3T3-L1前脂肪细胞在诱导分化为3T3-L1脂肪细胞的过程中，胞浆中脂肪滴从无到有，由小变大，细胞形态逐渐变圆，在诱导分化至9-10天左右，采用油红O染色观察。 2.MTT检测结果:确定荔枝核提取物在浓度为0.4mg/mL和0.2mg/mL时，作用于脂肪细胞48h，对其增值无显著影响。 3.荔枝核提取物对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响:实验的结果显示，地塞米松有明显抑制3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖摄取的作用;荔枝核提取物高剂量组能显著改善胰岛素抵抗，促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的吸收，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。 4.荔枝核提取物对3T3-L1脂肪细胞RETN mRNA、PTP1B mRNA及GRP78 mRNA表达水平的影响:Real-time PCR结果显示，荔枝核提取物高、低剂量组的RETNmRNA、GRP78 mRNA表达均显著下降，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01); PTP1B mRNA表达以高剂量组的下降明显，与模型组比较，差异有显著性差异(P＜0.05)。 结论: 1.荔枝核提取物明显降低高脂饮食加链脲佐菌素诱导胰岛素抵抗2型糖尿病大鼠空腹血糖水平，提高2型糖尿病大鼠的胰岛素敏感指数(ISI)，降低稳态胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，提示荔枝核提取物具有改善胰岛素β细胞功能的作用，这与改善大鼠胰组织病理损伤结果相一致，其改善胰岛素抵抗的作用机制与抑制胰组织内质网应激关键蛋白GRP78及CHOP的mRNA基因表达，从而改善胰岛的内质网应激损伤有关。 2.荔枝核提取物可明显提高胰岛素抵抗3T3-L1成熟脂肪细胞葡萄糖的消耗量，其作用机制与抑制RETN mRNA、GRP78 mRNA和PTP1B mRNA的表达、从而改善胰岛素信号传导有关。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 糖尿病与内质网应激

一、糖尿病的概述

二、内质网应激与T2DM的关系

第二节 2型糖尿病的治疗

一、胰岛素及口服降糖药

二、新型降糖药

三、中药治疗

第三节 荔枝核治疗糖尿病的研究进展

第四节 结语

第二章 荔枝核提取物改善高脂饮食加链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗作用及机制研究

一、材料与试剂

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三章 荔枝核提取物改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗作用及机制研究

第一节 荔枝核提取物对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二节 荔枝核提取物3T3-L1前脂肪诱导分化的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三节 荔枝核提取物对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第四节 荔枝核提取物对RETN、PTP1B及GRP78基因mRNA表达的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

结语

参考文献

在校期间发表论文情况

致谢