MiR--124--3p靶向调控CD151蛋白参与胃癌发生及CD151蛋白与中医证型相关性探讨

摘要

研究背景和目的: 近几年研究表明，一种小片段非编码的RNA与各种与这些胃癌相关性基因表达关系密切，这种小片段非编码RNA被称为microRNA(miRNA)。MiRNA以一种特殊的形式对各类胃癌相关性基因起微调控作用——转录后调控[1，2]，因此，miRNA通过转录后调控的形式直接或间接影响某些蛋白的表达最后参与胃癌发生与发展全过程。MiR-124-3p是miR-124的亚型之一，其生物学功能大部分与miR-124家族相重叠，既与细胞的增殖及迁移相关。有报道指出miR-124家族普遍在乳腺癌细胞中都存在异常表达，在其它系统的癌组织也有类似的表达情况，因此推测miR-124家族中的miR-124-3p与胃癌的发生发展亦具有相关性。与miR-124-3p碱基序列具有高度同源性的CD151基因，所编码的CD151蛋白是四跨膜蛋白家族(Tetraspanins，TM4SF)成员之一，它在多种人类肿瘤中表达水平显著高于正常组织，且与肿瘤的预后密切相关[3]。CD151蛋白参与多种病理生理过程，包括细胞的黏附、迁移、半桥粒结构的形成以及通过囊泡进行整合素的运输等[4，5]，因此CD151可能对肿瘤细胞的迁移，浸润和转移起重要作用;中西医结合治疗胃癌是近几年临床上提倡的治疗方式[6]，因为中医学在胃癌治疗过程中不仅能有效地抑制胃癌的发展，还能减低西医治疗时引起的不适，提高患者对胃癌治疗的耐受力，最终提高患者存活率及生存质量[7,8]，然而对胃癌患者进行中医或中西医结合治疗关键在于辨证，辨证方能论治。 综上所述，本课题的研究目的如下: 1明确miR-124-3p在临床胃癌组织中的表达差异，研究临床上miR-124-3p与CD151蛋白表达的相关性，探讨miR-124-3p在胃癌发生与发展中的重要作用。 2通过细胞学实验验证miR-124-3p的表达水平对离体胃癌细胞的增殖、凋亡、侵袭与迁移的影响，从细胞学的角度探究miR-124-3p与胃癌发展的相关性，通过靶点验证分析miR-124-3p是否对胃癌转移相关基因CD151存在调控位点，明确其调控机制。 3研究不同中医症候临床分型胃癌患者癌变组织CD151蛋白表达差异，探讨胃癌患者中医证候临床分型与CD151蛋白表达情况的相关性;初探CD151蛋白表达水平与胃癌转移相关性。 方法: 1临床上不同组织内miR-124-3p与CD151的表达情况 (1)临床标本收集:以广州军区广州总医院消化内科住院部及门诊部确诊“胃癌”患者为研究对象，收集患者胃镜下钳取的胃癌及癌旁周围正常组织为实验标本，同时将一部分标本送至病理科进行病理诊断。 (2) MiR-124-3p检测:采用实时荧光定量PCR对实验标本进行miR-124-3p表达水平的检测，以U6基因作为内参照，以相对定量的形式确定胃癌与癌旁周围正常组织内miR-124-3p表达水平高低。 (3) CD151蛋白检测:采用蛋白免疫印迹实验对实验标本进行CD151蛋白表达水平的检测，以β-actin基因作为内参照，以相对定量的形式确定组织内CD151蛋白表达水平。 2 MiR-124-3p对胃癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响 (1)实验组的建立:构建特异性miR-124-3p模拟物miR-124-3p-minics与miR-124-3p拮抗物miR-124-3p-inhibitors，利用脂质体载体转染技术构建不同表达水平MGC803细胞（广州军区总医院医学实验科提供），与空白对照组细胞一起构建高表达组、中表达组及低表达组细胞进行实验。 (2)细胞增殖与凋亡:采用RTCA细胞实时监测系统、流式细胞术及DAPI染色实验对不同miR-124-3p表达水平细胞进行监控，探究miR-124-3p表达水平对离体胃癌细胞的增殖与凋亡的影响。 (3)细胞的迁移:采用划痕实验对不同miR-124-3p表达水平细胞进行实验，探究miR-124-3p表达水平对离体胃癌细胞迁移能力的影响。 3 MiR-124-3p对细胞迁移相关基因CD151调控的探究 (1)MiR-124-3p对CD151蛋白的调控:利用脂质体载体转染技术构建不同MiR-124-3p表达水平细胞(MGC803)，采用蛋白免疫印迹实验对MiR-124-3p不同表达水平标本进行CD151蛋白表达水平的检测，利用spearman对MiR-124-3p与CD151的表达水平进行相关性分析。 (2)靶点验证:利用PCR与突变PCR构建CD151野生及突变载体，脂质体转染构CD151野生型及突变型胃癌细胞，采用pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告实验对miR-124-3p的作用靶点进行分析，确定miR-124-3p确实对CD151基因存在位点，并确定该位点存在于3' URT或5' URT。 4 CD151蛋白胃癌组织中表达情况与中医证型及胃癌转移相关性 (1)中医辨证分型:根据《中医诊断学》相关要求，运用祖国医学四诊合参对所有“胃脘痛”患者进行中医临床症候分型的辨证，仔细记录并在副主任医师以上级别中医师指导下完成中医辨证分型。 (2)临床标本获取:以广州军区广州总医院消化内科住院部及门诊部确诊“胃癌”患者为研究对象，收集患者胃镜下钳取的胃癌及癌旁周围正常组织为实验标本，同时将一部分标本送至病理科进行病理诊断。 (3) CD151蛋白检测:采用蛋白免疫印迹实验对实验标本进行CD151蛋白表达水平的检测，以β-actin基因作为内参照，以相对定量的形式确定组织内CD151蛋白表达水平。 (4) CD151蛋白对细胞迁移及凋亡影响:以CD151高表达MGC803细胞株、空白质粒MGC803细胞株及CD151低表达MGC803细胞株（广州军区总医院医学实验科提供）建立不同CD151蛋白表达水平组，进行划痕实验和流式细胞实验。 5统计学分析 (1)应用SPSS13.0软件包进行统计学分析。采用单样本K-S拟合优度检验提示，各资料均符合正态分布，p＞0.05。计量资料以均数±标准差（(x)±S）表示，所有数据均满足方差齐性，p＞0.05。 (2)采用单因素方差分析进行组间均数比较，多重比较采用LSD法。显著性水准α取0.05，双侧。 (3)用相关系数从数量上描述miR-124-3p相对表达量与CD151蛋白相对表达量之间的相关程度，用r来表示，相关系数取值范围限于:-1≤r≤+1，越接近0表示相关性越小，越接近±1表示正/负相关性越大。 结果: 1临床上不同组织内miR-124-3p与CD151的表达情况 (1)相对于癌旁周围正常组织，miR-124-3p在胃癌组织内表达水平下调（胃癌组织内miR-124-3p相对表达量为15.63±3.68、癌旁周围正常组织为37.13±2.35，p＜0.05) (2)相对于癌旁周围正常组织，CD151在胃癌组织内表达水平上调（胃癌组织内CD151蛋白相对表达量为63.79±7.11、癌旁周围正常组织为14.35±1.86，p＜0.05） (3)在胃癌及癌旁周围正常组织中，miR-124-3p的相对表达量与CD151的相对表达量呈负相关，r=-0.78. 2 MiR-124-3p对胃癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响 (1)构建不同miR-124-3p表达水平模型组后，不同组细胞miR-124-3p表达水平分别为:上调组miR-124-3p相对表达量为71.346±8.539、对照组为45.861±1.626、下调组为7.278±3.193，p＜0.05。 (2) RTCA细胞实时监测系统结果为:上调组细胞RTCA增殖系数为4.028±0.253、对照组为7.132±0.791、下调组为7.832±0.944，p＜0.05。 (3) DAPI染色实验结果为:上调组细胞凋亡细胞数为9.900±2.918、对照组为2.450±1.234、下调组为2.000±0.794，p＜0.05。 (4)流式细胞术实验结果为:上调组细胞细胞凋亡率为17.050±1.504、对照组为7.850±2.059、下调组为8.150±2.084，p＜0.05。 (5)划痕实验结果为:上调组细胞划痕移动距离为0.325±0.192、对照组为2.605±0.560、下调组为4.865±0.790，p＜0.05。 3 MiR-124-3p对细胞迁移相关基因CD151调控的探究 (1)MGC803细胞模型中，miR-124-3p与CD151蛋白表达呈负相关（上调组miR-124-3p相对表达量为71.700±11.157、对照组为49.905±9.956、下调组为6.932±3.351;上调组CD151蛋白相对表达量为19.825±12.144、对照组为42.824±1.108、下调组为73.810±10.115, r=-0.843, p＜0.05); (2)成功构建CD151野生及突变载体，pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告实验结果野生型或突变型载体相对荧光值为0.87±0.05和1.03±0.06，差异未达30％以上，提示miR-124-3p对CD151基因的3'UTR不存在明显的调控作用。 4 CD151蛋白胃癌组织中表达情况与中医证型及胃癌转移相关性 (1)本实验组所有胃癌患者患者中医证型以“痰瘀互结”为主，占38.5％，明显高于其他证型比率。 (2)相对于癌旁周围正常组织，胃癌组织中CD151蛋白表达上调（胃癌组织中CD151蛋白相对表达量为79.204±6.706、癌旁周围正常组织为34.652±2.539，p＜0.05）。 (3)“痰瘀互结”证型患者胃癌组织CD151蛋白表达水平较其他证型高(74.643±8.310, p＜0.05)。 (4)远端转移患者CD151蛋白表达量较高(83.427±9.445，p＜0.05)。 (5)划痕实验中CD151蛋白高表达细胞组12小时后划痕距离较其他组距离明显缩短(2.02±0.11μ m，p=0.000);流式细胞实验中CD151蛋白高表达细胞组凋亡率为3.21±0.25％(p=0.000)，抗凋亡能力较其他组强。 结论: 1临床上胃癌患者胃癌细胞中存在miR-124-3p的低表达跟CD151蛋白的过表达，提示两者的表达异常与胃癌的发生相关; 2临床上，miR-124-3p的表达水平与CD151蛋白的表达水平呈负相关，细胞学实验中miR-124-3p能下调CD151蛋白的表达，但靶点实验提示miR-124-3p与CD151基因mRNA的3'UTR结合不明显，提示miR-124-3p可能通过对与CD151基因5'UTR区域结合或其它途径间接地调控CD151蛋白的表达，从而在胃癌的发生与发展过程扮演重要角色。 3本实验组中胃癌患者中医症候临床分型以“痰瘀互结型”为主，该证型患者胃癌组织CD151蛋白表达较其它证型高，提示“痰湿”与“瘀血”可能导致CD151蛋白高表达间接参与胃癌发生及发展; 4临床上有远端转移的胃癌患者其胃癌组织内CD151蛋白的表达水平更高，细胞学实验中CD151蛋白高表达能导致胃癌细胞迁移及增殖能力增加，暗示CD151蛋白高表达可能是导致胃癌远端转移的因素之一，临床上可尝试把CD151蛋白表达水平作为一项胃癌病情发展的评估指标。

目录

声明

摘要

引言

第一章 临床上胃癌组织中miR-124-3p、CD151蛋白表达水平及两者相关性研究

1．1 文献研究

1．1．1 MiRNA与人类疾病及胃癌相关性

1．1．2 本章节研究意义与特色

1．2 材料与方法

1．2．1 主要仪器与耗材

1．2．2 主要试剂

1．2．3 实验方法与步骤

1．2．4 统计学方法

1．3 结果

1．3．1 临床上不同组织内miR-124-3p的表达情况

1．3．2 临床上不同组织内CD151蛋白的表达情况

1．3．3 临床上miR-124-3p相对表达水平与CD151蛋白相对表达水平相关性

1．4 结论

第二章 MiR-124-3p对胃癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响

2．1 文献研究

2．1．1 MiR-124-3p与人类生理病理相关研究进展

2．1．2 本章节研究的意义与特色

2．2 材料与方法

2．2．1 主要仪器与耗材

2．2．2 主要试剂

2．2．3 实验方法与步骤

2．2．4 统计学方法

2．3 结果

2．3．1 不同miR-124-3p表达组构建结果

2．3．2 不同miR-124-3p表达组细胞增殖情况

2．3．3 不同miR-124-3p表达组细胞凋亡情况

2．3．4 不同miR-124-3p表达组细胞迁移情况

2．4 结论

第三章 MiR-124-3p对细胞迁移相关基因CD151调控的探究

3．1 文献研究

3．1．1 CD151与消化系统肿瘤转移相关性研究

3．1．2 本研究项目意义与特色

3．2 材料与方法

3．2．1 主要仪器与耗材

3．2．2 主要试剂

3．2．3 实验方法与步骤

3．2．4 统计学方法

3．3 结果

3．3．1 mR-124-3p与CD151在MGC803细胞中表达情况

3．3．2 不同表达载体构建结果

3．3．3 pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酵报告

3．4 结论

第四章 CD151蛋白胃癌组织中表达情况与中医证型及胃癌转移相关性

4．1 文献研究

4．1．1 CD151蛋白与胃癌及胃癌与中医学研究进展

4．1．2 本研究意义与特色

4．2 材料与方法

4．2．1 主要仪器与耗材

4．2．2 主要试剂

4．2．3 实验方法与步骤

4．2．4 统计学分析

4．3 结果

4．3．1 胃癌患者中医证型分布规律

4．3．2 免疫印迹实验结果

4．3．3 不同表达组CD151蛋白表达情况

4．3．4 划痕实验结果

4．3．5 流式细胞术实验结果

4．4 结论

全文总节

参考文献

附录

缩写词简表

在校期间发表论文情况

致谢