柚皮素滴眼液对光感受器细胞凋亡的防治作用及机制研究

摘要

目的:
　　柚皮素是一种具有多种眼科药理作用的黄酮类化合物，前期预实验发现1％柚皮素滴眼液对N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)诱导的大鼠光感受器细胞凋亡具有防治作用。因此，本课题进行1％柚皮素滴眼液眼部药代动力学研究，并进一步明确柚皮素滴眼液对MNU诱导大鼠光感受器细胞凋亡的防治作用，体外实验以光损伤和H2O2诱导的小鼠视锥细胞(661W细胞株)损伤模型为研究对象，探讨柚皮素对光感受器细胞凋亡的作用机制。
　　方法:
　　(1)柚皮素滴眼液眼部药代动力学研究:新西兰兔滴眼给予1％柚皮素滴眼液，每眼1滴(50μL)，在给药后的相应时间点采血，处死动物，摘眼球，分离眼球组织，采用LC-MS/MS方法测定角膜、房水、玻璃体、视网膜以及血浆中柚皮素的浓度。
　　(2)柚皮素滴眼液对MNU诱导的光感受器细胞凋亡的防治作用研究:单剂量腹腔注射MNU建立大鼠光感受器细胞凋亡模型，大鼠双眼在造模前7天至造模后17天分别滴眼给予溶剂滴眼液、0.5％和1％柚皮素滴眼液，一天三次，每次每眼一滴。通过视觉电生理仪检查视网膜功能、水迷宫行为学试验以及HE染色组织病理学检查综合评价柚皮素滴眼液对MNU诱导的大鼠光感受器细胞凋亡的作用。
　　(3)柚皮素对光诱导的661W细胞凋亡的防治作用机制研究:体外培养661W细胞株，通过光照8h建立661W细胞光损伤模型，造模后即刻加入0.5-100 mg/L柚皮素溶液孵育24 h。通过MTT法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡率，荧光酶标仪检测细胞内ROS浓度。
　　(4)柚皮素对H2O2诱导的661W细胞氧化损伤的防治作用机制研究:体外培养661W细胞株，新鲜配制的5μmol/L H2O2与细胞孵育4h，换液，加入0.5-100 mg/L柚皮素溶液孵育24 h。通过MTT法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡率，荧光酶标仪检测细胞内ROS浓度。
　　结果:
　　(1)柚皮素滴眼液眼部药代动力学研究:建立了测定柚皮素的LC-MS/MS方法，其方法学验证表明方法的灵敏度、专属性、准确度、精密度、线性以及回收率符合生物样品分析方法验证的要求，适合用于柚皮素滴眼液的眼部药代动力学研究。参数AUC(0-t)显示，在角膜上柚皮素的暴露量最大，房水、视网膜以及玻璃体次之;柚皮素在角膜、房水、玻璃体、视网膜的Cmax分别在给药后的0.083、0.75、0.083和0.083h达到67945.30±4109.34 ng/g、1325.69±239.34 ng/mL、160.52±38.78 ng/mL和1927.08±660.77 ng/g;各眼部组织的半衰期分别为9.37、0.65、1.17和4.62 h。在Cmax和Tmax两个参数上可以看出血浆中总柚皮素与游离柚皮素浓度比较无统计学差异，总柚皮素的Cmax在给药后0.083 h达到35.12±0.54 ng/mL。
　　(2)柚皮素滴眼液对MNU诱导的光感受器细胞凋亡的防治作用研究:视觉电生理仪检测闪光视网膜电图(FERG)和视网膜振荡电位(OPs)结果显示溶剂对照组大鼠的振幅显著下降，潜伏期显著延长。与溶剂对照组比较，0.5％和1％柚皮素滴眼液显著逆转MNU模型大鼠的振幅下降和潜伏期的延长。行为学水迷宫试验结果显示:与溶剂对照组比较，0.5％和1％柚皮素滴眼液都能增加穿越次数(P＜0.05)。视网膜形态学结果显示柚皮素滴眼液能剂量依赖性地保护大鼠视网膜功能和结构。
　　(3)柚皮素对光诱导的661W细胞凋亡的防治作用机制研究:MTT法检测结果显示100 mg/L柚皮素对正常培养状态下的细胞增殖无影响，溶剂对照组细胞存活率显著降低，而1-100 mg/L柚皮素有促进光损伤细胞存活的作用。流式细胞术检测结果显示溶剂对照组细胞的凋亡细胞显著增加，10 mg/L柚皮素有抑制光损伤细胞凋亡的作用。荧光探针H2DCFDA检测结果显示，溶剂对照组细胞内ROS显著增加，10 mg/L柚皮素具有逆转作用。
　　(4)柚皮素对H2O2诱导的661W细胞氧化损伤的防治作用机制研究:MTT法检测结果显示溶剂对照组细胞的存活率显著降低，而5-100 mg/L柚皮素干预后，661W氧化损伤细胞的活性明显增强。流式细胞术检测结果显示溶剂对照组细胞的凋亡细胞显著增加，10 mg/L柚皮素有抑制氧化损伤细胞凋亡的作用。荧光探针H2DCFDA检测结果显示，溶剂对照组细胞内ROS显著增加，10 mg/L柚皮素具有逆转作用。
　　结论:
　　(1)1％柚皮素滴眼液滴眼给药后，柚皮素在新西兰兔视网膜中能够达到有效的治疗浓度，表明柚皮素滴眼给药有望成为治疗眼底病的有效给药途径。
　　(2)柚皮素滴眼液能有效地降低视网膜功能和组织结构的损伤，改善视功能。因此，柚皮素可能成为一种治疗视网膜色素变性新的候选药物。
　　(3)柚皮素对光诱导的661W细胞凋亡模型具有防治作用;柚皮素抗光诱导的661W细胞的凋亡作用可能与减少氧化应激的发生有关。
　　(4)柚皮素可以减轻H2O2诱导的661W细胞氧化损伤;柚皮素抗H2O2诱导的661W细胞的凋亡作用可能是通过减少氧化应激实现的。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献综述

1 国内外研究现状和趋势

1．1 RP的发病机制

1．2 光感受器细胞凋亡的相关机制

1．3 光感受器细胞凋亡通路

1．4 RP的治疗方法

1．5 RP的动物模型和细胞模型

1．6 柚皮素的研究概况

2 本课题组前期预实验结果

3 回顾与小结

第二章 研究部分

第一节 柚皮素滴眼液眼部药代动力学研究

1 实验材料

2 实验方法

3 试验结果

4 讨论

5 结论

第二节 柚皮素滴眼液对MNU诱导的光感受器细胞凋亡的防治作用研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第三节 柚皮素对光诱导的661W细胞凋亡的防治作用机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第四节 柚皮素对H2O2诱导的661W细胞损伤的防治作用机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第三章 结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢

附件