来源于海洋生物的候选Ⅰ类新药POA的早期肝肾细胞毒性研究

摘要

目的:
　　恶性肿瘤是一种严重危害人民生命健康的常见病，是仅次于心脑血管病的第二位死因，经调查其发病率近年来逐年增加。然而目前癌症治疗效果还不是很理想，攻克癌症的艰巨性以及癌症危害的严重性到今日已引起许多国家政府、公众和科学界的巨大重视。所以，攻克肿瘤的主要途径仍然是寻找和开发高效低毒的抗肿瘤药物。抗肿瘤海洋候选新药POA是从海洋共附生真菌Penicillium sp.中分离得到的一种结构新颖的二氢噻吩并色酮类化合物。大量的前期研究证明POA对抑制恶性黑色素瘤细胞株A375、肺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株HeLa、乳腺癌细胞株MCF-7、喉癌细胞株Hep-2、肝癌细胞株HepG2、肠癌细胞株SW-620有显著性作用(IC50≤10μM)。本实验以其为研究对象，在人正常肝细胞L-02、人肾近曲小管上皮细胞HK-2上进行POA体外染毒实验，对其作为抗肿瘤候选新药的早期安全性进行评价。采用CCK8法、Hoechst染色形态学观察，检测不同浓度POA对人正常肝细胞L-02、人肾近曲小管上皮细胞HK-2的毒性。探究POA产生细胞毒性的机制，通过Caspase-3活性检测，并通过PI、AnnexinⅤ/PI染色给药后的L-02、HK-2细胞，运用流式细胞仪，检测细胞周期和细胞早期凋亡率。进一步利用紫外分光光度法测定POA作用后肝肾细胞样本，通过考察AST、ALT、LDH、NAG、SOD、MDA、GSH、NO、NOS值变化，同时检测活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)、ATP、线粒体膜通透孔(MPTP)的值，探讨POA产生细胞毒性的机制。再进一步通过Western-bloting实验，检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Fas、Cyt-C的表达，进一步阐明POA导致肝肾毒性的作用机制。通过上述检测方法和指标来综合评价POA的体外肝肾毒性以及导致肝肾细胞毒性的浓度范围和引发肝肾毒性的机制，评价其作为抗肿瘤候选新药的安全性。
　　方法:
　　1.CCK8法检测POA对细胞的抑制率
　　利用CCK8中[2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被活细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物的这一特性对POA对肝肾细胞的毒性进行分析。
　　2.Hoechst33258染色观察细胞形态学变化
　　不同浓度的POA处理肝肾细胞，Hoechst33258进行染色，于荧光显微镜下观察细胞形态的改变，评估药物对细胞引起的凋亡情况。
　　3.PI、AnnexinⅤ/PI染色检测细胞周期及早期凋亡情况
　　采用流式细胞仪技术记录细胞的周期分布及凋亡比例情况，以Sub-G1期及AnnexinⅤ+/PI-象细胞所占比例作为细胞凋亡判别指标，研究不同剂量POA对肝肾细胞凋亡的影响。
　　4.肝肾细胞中Caspase家族活性的影响
　　采用Caspase-3活性检测试剂盒检测不同浓度给药组肝肾细胞的Caspase-3活性，研究POA对Caspase家族活性的影响。
　　5.AST、ALT、LDH、NAG、SOD、MDA、GSH、NO、NOS指标检测
　　在药物作用的24 h后，取培养液的上清液或细胞裂解液，按各试剂盒中所述方法对SOD，MDA，LDH，GSH，NOS，NO，AST，ALT进行测定，检测POA对肝肾细胞氧化应激平衡的影响。
　　6.肝肾细胞中活性氧(ROS)的的影响感官
　　活性氧(Reactive oxygen species，ROS)包括氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。采用活性氧捕获剂DCFH-DA，运用流式细胞仪技术检测细胞活性氧值的变化。
　　7.Western-bloting技术检测凋亡相关蛋白的表达
　　运用蛋白质印迹法，通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞样品进行着色的基本原理分析Bax、Bcl-2、Fas蛋白质在所分析的细胞中的表达情况，来反应POA对肝肾细胞中与线粒体通路相关蛋白的影响。
　　8.线粒体膜电位（MMP）、ATP、线粒体膜通透孔(MPTP)的值、Cyt-C蛋白的表达
　　运用荧光染料JC-1，收集细胞样品按试剂盒所述方法检测细胞的荧光强度，计算POA对肝肾细胞MMP的影响;运用ATP、MPTP检测试剂盒，按各试剂盒中所述方法进行检测，同时运用Western-bloting技术检测线粒体相关蛋白Cyt-C的表达，综上总结POA对肝肾细胞线粒体通路的影响。
　　结果:
　　1.POA对细胞的抑制率结果
　　POA对L-02、HK-2细胞均具有显著抑制作用，且其抑制效应呈现一定的时间-剂量相关性。在L-02细胞中，24 h时间段，POA体外抑制作用随着给药浓度的增加呈现显著性的递增趋势。0～60μmol·L-1范围内，48 h，72 h两个时间段都呈现明显的剂量相关性，剂量达到60μmol·L-1时，POA对L-02细胞抑制作用进入平台期且接近最大值，当用药浓度从60μmol·L-1继续增加到100μmol·L-1时，细胞抑制作用也不再增强。在HK-2细胞中，其有效抑制浓度为20～100μmol·L-1，在20～90μmol·L-1范围内，三个时间段都呈现明显的剂量相关性，剂量达到90μmol·L-1时，72 h段POA对HK-2细胞抑制作用进入平台期、并接近最大值，以后POA用药剂量再增加，体外抑制作用也不再增强。从作用时间分析，POA体外作用24 h、48 h和72 h的三者抑制作用，经统计学处理，有显著性差异（P＜0.05）。
　　2.细胞形态学变化
　　分别用POA(0，20，40μM)处理L-02、HK-2细胞:倒置相差显微镜下观察，正常L-02细胞呈上皮样，正常HK-2细胞呈铺路石样,且肝肾细胞均边界清晰，紧密衔接且贴壁生长;死亡细胞形态模糊，细胞皱缩，边界不清，并出现部分裂解现象。荧光显微镜下观察，正常活细胞呈微弱蓝色，细胞分布较为均匀，且边界清晰;凋亡细胞的细胞核碎裂或固缩，致密浓染呈亮蓝色，且细胞浓染现象随着POA浓度的递增而加重。
　　3.细胞周期及早期凋亡结果
　　在L-02细胞中，POA(10、20、40μmol·L-1)组与对照组相比，Sub-G1、S、G2/M期细胞比例明显增多(P＜0.01），而G1期细胞比例呈明显下降趋势(P＜0.001)，可见POA引起了L-02细胞的凋亡;以AnnexinⅤ-FITC为横轴，PI为纵轴，其早期凋亡率(AnnexinⅤ+/PI-)分别为10.5％、16.4％、20.1％，可见随着POA含量的增大细胞早期凋亡率逐渐增大，即呈一定的浓度依赖相关性。
　　在HK-2细胞中，POA(20、40、80μmol·L-1)组与对照组相比，Sub-G1、S、G2/M期细胞比例明显增多(P＜0.01），而G1期细胞比例呈明显下降趋势(P＜0.001)，可见POA引起了HK-2细胞的凋亡;其早期凋亡率(AnnexinⅤ+/PI-)分别为3.4％、23.0％、30.8％，可见同样的随着POA含量的增大细胞早期凋亡率逐渐增大，即呈一定的浓度依赖相关性。
　　4.Caspase-3活性的影响
　　在L-02细胞中，POA(10、20、40μmol·L-1)组的Caspase-3活性分别为对照组的1.32、1.44、1.62倍，可见Caspase-3活性随给药浓度的上升而上升，与剂量呈正相关(P＜0.001)，说明POA引起L-02细胞的死亡经过了凋亡过程。
　　在HK-2细胞中，POA(20、40、80μmol·L-1)组的Caspase-3活性分别为对照组的1.19、1.43、1.71倍.,可见Caspase-3活性随给药浓度的上升而上升，与剂量呈正相关(P＜0.01)，说明POA引起HK-2细胞的死亡经过了凋亡过程。
　　5.氧化应激平衡的影响
　　在L-02、HK-02细胞中，与空白对照组相比，POA均降低了抗氧化酶GSH、SOD及NO、NOS的活性，增加了氧化物质MDA、LDH、NAG及ALT、AST的量，破坏了细胞的氧化平衡，产生了氧化压。
　　6.活性氧(ROS)的影响
　　在L-02细胞中，POA(10、20、40μmol·L-1)组的ROS产生量值为14.2、19.523.1，而空白对照组的值为4.2，可见ROS产生量随给药浓度的上升而上升，与剂量呈正相关，说明POA对L-02细胞产生了损害，引起了ROS值的增加。
　　在HK-2细胞中，POA(20、40、80μmol·L-1)组的ROS产生量值为3.8、6.2、15.2，而空白对照组的值为0.9，可见ROS产生量随给药浓度的上升而上升，与剂量呈正相关，说明POA对HK-2细胞产生了损害，引起了ROS值的增加。
　　7.凋亡相关蛋白表达的影响
　　在L-02细胞中，与对照组比较，POA显著增加促凋亡蛋白Fas及Bax的表达(P＜0.01)，同时降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P＜0.001)，且有一定的浓度依赖性，表明线粒体的相关信号通路参与了POA引起的L-02细胞凋亡。
　　在HK-2细胞中，与对照组比较，POA显著增加促凋亡蛋白Fas及Bax的表达(P＜0.01)，同时降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P＜0.001)，且有一定的浓度依赖性，表明线粒体的相关信号通路参与了POA引起的HK-2细胞凋亡。
　　8.线粒体损伤机制的研究结果
　　在L-02细胞中，POA（10、20、40μmol·L-1）组的MMP下降百分率分别为15.1％、20.3％、26.1％，而空白对照组的值为10.4％; ATP值随着给药浓度的上升而下降、MPTP随着给药浓度的上升而增大;透射电镜观察细胞线粒体内部结构空泡样变面积随给药浓度的上升而增大;胞质中的细胞色素的含量与对照组相比随给药浓度的上升而增大。综上所诉，POA对L-02细胞线粒体产生了损害;且损害程度随着给药浓度的上升而变严重。
　　在HK-2细胞中，POA(20、40、80μmol·L-1)组的MMP下降百分率分别为14.8％、16.2％、26.5％; ATP值随着给药浓度的上升而下降、MPTP随着给药浓度的上升而增大;透射电镜观察细胞线粒体内部结构空泡样变面积随给药浓度的上升而增大;胞质中的细胞色素的含量与对照组相比随给药浓度的上升而增大。综上所诉，POA对HK-2细胞线粒体产生了损害，且损害程度随着给药浓度的上升而变严重。
　　结论:
　　来源于海洋生物的候选Ⅰ类新药POA对正常人肝肾细胞有细胞毒作用，且与时间-剂量呈一定的相关性，其机制可能与其调控凋亡相关蛋白有关，经过了线粒体凋亡途径且与氧化应激平衡损害有关，POA细胞毒性作用的其它机制尚有待进一步研究。

目录

声明

论文说明

摘要

引言

第1章 文献研究

第1节 抗肿瘤药物的研究概况

1．1 抗肿瘤药物研究现状

1．2 抗肿瘤海洋药物的研究现状

第2节 POA研究概况

第3节 药物体外毒性研究概况

3．1 新药早期毒性研究现状

3．2 药物对肝肾细胞毒性研究概况

第2章 POA对人正常肝细胞L-02体外毒性研究与结果分析

第1节 POA对L-02细胞毒性大小

1．1 材料

1．2 方法

1．3 统计学处理方法

1．4 结果

1．5 小结与讨论

第2节 POA对L-02细胞形态学的影响

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 小结与讨论

第3节 POA对L-02细胞凋亡的影响

3．1 材料

3．2 方法

3．3 统计学处理方法

3．4 结果

3．5 小结与讨论

第4节 POA对L-02细胞凋亡相关蛋白的影响

4．1 材料

4．2 方法

4．3 统计学处理方法

4．4 结果

4．5 小结与讨论

第5节 POA对L-02细胞氧化应激平衡及活性氧(ROS)的影响

5．1 材料

5．2 方法

5．3 统计学处理方法

5．4 结果

5．5 小结与讨论

第6节 POA对L-02细胞线粒体功能的影响

6．1 材料

6．2 方法

6．3 统计学处理方法

6．4 结果

6．5 小结与讨论

第3章 POA对人肾近曲小管上皮细胞HK-2体外毒性研究与结果分析

第1节 POA对HK-2细胞毒性大小

1．1 材料

1．2 方法

1．3 统计学处理方法

1．4 结果

1．5 小结与讨论

第2节 POA对HK-2细胞形态学的影响

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 小结与讨论

第3节 POA对HK-2细胞凋亡的影响

3．1 材料

3．2 方法

3．3 统计学处理方法

3．4 结果

3．5 小结与讨论

第4节 POA对HK-2细胞凋亡相关蛋白的影响

4．1 材料

4．2 方法

4．3 统计学处理方法

4．4 结果

4．5 小结与讨论

第5节 POA对HK-2细胞氧化应激平衡及活性氧(ROS)的影响

5．1 材料

5．2 方法

5．3 统计学处理方法

5．4 结果

5．5 小结与讨论

第6节 POA对HK-2细胞线粒体的影响

6．1 材料

6．2 方法

6．3 统计学处理方法

6．4 结果

6．5 小结与讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢