穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒的研究

摘要

目的:
　　制备穿膜肽介导的纳米给药系统——穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒，并对其进行表征。在细胞水平及荷瘤动物上评价该纳米粒逆转肿瘤多药耐药、抑制肿瘤生长的作用，为该纳米给药系统在耐药结肠肿瘤治疗提供研究思路。
　　方法:
　　通过多肽固相合成法合成N端为半胱氨酸的八聚天冬氨酸的氨基酸序列(Cys-Asp8)，通过二硫键与穿膜肽-聚乙二醇(TAT-PEG5000)共价偶联，得到穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸聚合物（TAT-PEG5000-Asp8），并对其进行表征。随后将阿霉素化学偶联到穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸上，形成了两亲性材料(TAT-PEG-Asp8-Dox)，该材料在水溶液中能自组装形成纳米粒。通过荧光探针法测定该材料的临界胶束浓度，采用激光粒度仪测定其粒径和电位，用透射电子显微镜观察纳米粒的形态及分散均匀度，荧光光度法测定载药量，并研究了该纳米粒的还原敏感性。在体内外对纳米粒进行了药效学评价，用流式细胞仪研究该纳米粒的细胞摄取率，激光共聚焦观察其在耐药细胞中的入核能力，用MTT法考察纳米粒对肿瘤细胞的抑制作用，采用AnnexinⅤ/PI双染法考察纳米粒对肿瘤细胞促凋亡作用;并在荷耐药结肠癌移植瘤的nu/nu裸小鼠动物模型上考察纳米粒的体内治疗效果。
　　结果:
　　合成了多功能的穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素载药材料，该材料在水溶液中能够自组装形成纳米粒。该纳米粒的粒径约为150 nm，Zeta电位为+15 mV，TEM结果显示纳米粒呈球形，且分布均匀，载药量为8.6％。体外细胞实验结果显示，TAT修饰的纳米粒细胞摄取量升高，尤其是在结肠癌耐药细胞上，有较好的核靶向能力;MTT实验结果表明，在耐药细胞中，纳米粒能有效地抑制耐药细胞的增殖;动物实验结果表明，在荷耐药结肠癌移植瘤的nu/nu裸小鼠动物模型上，有较好的肿瘤抑制作用。
　　结论:
　　本研究构建了穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米给药系统，体内外实验均表现出较好的逆转肿瘤多药耐药的效果，为结肠癌肿瘤多药耐药的治疗提供了一个新思路。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 穿膜肽的研究现状

1．1．1 穿膜肽的分类

1．1．2 穿膜肽的穿膜机制

1．1．3 穿膜肽应用

1．1．4 小结

1．2 纳米技术逆转肿瘤多药耐药的优势

1．2．1 肿瘤靶向性

1．2．2 延长循环时间

1．2．3 实现药物共载

1．2．4 刺激响应型递送

1．2．5 小结

第二章 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒的制备及表征

2．1 材料与仪器

2．1．1 材料

2．1．2 仪器

2．2 实验方法

2．2．1 巯基化聚天冬氨酸(Cys-Asps)的合成

2．2．2 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸(TAT-PEG-Asps)的合成

2．2．3 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素(TAT-PEG-Asps-Dox)的合成

2．2．4 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿毒素帷界胶束浓度(CMC)的测定

2．2．5 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒的制备

2．2．6 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒的透射电镜分析

2．2．7 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒载药量的测定

2．2．8 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒还原响应性考察

2．3 结果与讨论

2．3．1 聚天冬氨酸材料的表征

2．3．2 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素临界胶束浓度

2．3．3 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒的制备

2．3．4 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒的表征

2．3．5 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒载药量的测定

2．3．6 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒还原响应性考察

2．4 本章小结

第三章 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒的体外逆转肿瘤耐药研究

3．1 材料与仪器

3．1．1 材料

3．1．2 仪器

3．1．3 细胞

3．2 实验方法

3．2．1 常用试剂的配制

3．2．2 细胞培养及复苏

3．2．3 细胞摄取实验

3．2．4 耐药细胞的核靶向实验

3．2．5 耐药细胞滞留Dox的定量研究

3．2．6 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒逆转耐药实验

3．2．7 肿瘤细胞的增殖抑制实验

3．2．8 细胞凋亡

3．2．9 Western Blot检测P-糖蛋白(P-gP)的表达

3．3 结果与讨论

3．3．1 细胞摄取实验

3．3．2 耐药细胞的核靶向实验

3．3．3 耐药细胞滞留Dox的定量研究

3．3．4 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒逆转耐药结果

3．3．5 肿瘤细胞的增殖抑制实验

3．3．6 细胞凋亡

3．3．7 P-糖蛋白(P-gp)的表达

3．4 本章小结

第四章 穿膜肽-聚乙二醇-聚天冬氨酸-阿霉素纳米粒的体内逆转肿瘤耐药的研究

4．1 材料与仪器

4．1．1 材料

4．1．2 仪器

4．1．3 细胞系

4．1．4 实验动物

4．2 实验方法

4．2．1 肿瘤模型的建立

4．2．2 动物分组及给药方案

4．2．3 肿瘤及脏器的采集与处理

4．2．4 肿瘤穿透作用实验

4．2．5 统计学方弦

4．3 结果与讨论

4．3．1 肿瘤模型的建立

4．3．2 肿瘤生长曲线的测定

4．3．3 肿瘤重量及瘤重抑制率

4．3．4 动物体重变化

4．3．5 动物生存曲线

4．3．6 各组脏器的脏器系数及病理切片

4．3．7 肿瘤穿透能力研究

4．4 本章小结

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢