健脾化瘀解毒方调控Wnt通路介导胃癌前病变大鼠Lgr5+细胞的机制研究

摘要

目的:
　　①建立胃癌前病变大鼠实验模型，观察解毒方对胃癌前病变大鼠一般情况、宏观表征的影响，同时探讨解毒方对胃癌前病变大鼠胃黏膜肠上皮化生、异型增生病变的干预效应，以及胃黏膜上皮细胞超微结构的干预作用。
　　②观察Lgr5+细胞在胃腺体的空间定位、Lgr5+细胞数目变化，探讨Lgr5+细胞的生物学功能及在胃癌前病变中扮演的角色。同时探讨解毒方对Lgr5+细胞“离巢”事件的影响。
　　③检测Wnt/Lgr5信号通路的关键因子如Wnt1、Wnt3a、β-catenin、MMP-7、C-myc等在胃黏膜上皮组织中的表达水平，观察解毒方对以上Wnt/Lgr5信号通路关键因子的干预效应。
　　方法:
　　SPF级雄性SD大鼠77只，6-8周鼠龄，体质量120-140g，随机分为空白组（10只）、模型组（15只）、维酶素组（13只，0.2g·kg-1·d-1）、解毒方15 g·kg-1·d-1剂量组（13只，解毒方A组）、解毒方7.5g·kg-1·d-1剂量组（13只，解毒方B组）、解毒方3.75g·kg-1·d-1剂量组（13只，解毒方C组），共6组。空白组大鼠常规饲养，不予任何造模因素。模型组、维酶素组、解毒方各组大鼠给予200ug·mL-1 N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液自由饮用，配合饥饱失常法、小承气汤灌胃的综合造模方法复制胃癌前病变大鼠模型，持续19周。第9周从模型组随机选择2只大鼠，处死后取胃黏膜组织，确认出现胃黏膜肠上皮化生病变后，治疗组连续灌胃给药共10周。第19周，处死全部大鼠后取小弯侧胃体-窦交界处胃黏膜，制备胃黏膜上皮组织。采用AB-PAS染色法光镜下观察各组大鼠胃黏膜上皮肠上皮化生病变情况（肠上皮化生病灶范围及程度）;HE染色法光镜下观察各组大鼠胃黏膜上皮异型增生病变情况（主要包括胃黏膜上皮细胞异型性改变、腺体结构紊乱、异常分化状态）;透射电镜下观察各组大鼠胃黏膜上皮细胞超微结构变化（主细胞、壁细胞的细胞核形态、大小、染色质分布、核间隙、核浆比、胞浆空泡样变、线粒体结构、微管泡结构）。荧光定量RT-qPCR法检测各组大鼠胃黏膜上皮细胞C-myc mRNA表达。免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜上皮Lgr5表达，光镜下观察Lgr5+细胞在胃腺体的空间分布、Lgr5+细胞数目变化。免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜上皮Wnt1蛋白、Wnt3a蛋白、β-catenin蛋白、MMP-7蛋白的表达。
　　结果:
　　①胃黏膜HE染色显示，模型组大鼠胃黏膜上皮出现了异型增生病变（腺体结构不完整、排列拥挤、边界不清楚，甚至分支和折叠现象，细胞核深染，呈雪茄样改变，可见细胞核假复层改变，细胞核极性减弱，核分裂征象常见）。AB-PAS染色发现模型组大鼠出现弥漫性肠上皮化生病变（胃黏膜上皮发现范围较大的蓝染灶）。以上均表明胃癌前病变大鼠模型复制成功。数据显示，与模型组相比，解毒方各组大鼠弥漫性肠上皮化生发病率显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。与模型组相比，解毒方C组中-重度异型增生发病率显著降低（P＜0.05），解毒方A组、解毒方B组的中-重度异型增生发病率虽有不同程度降低，但无显著统计学意义（P＞0.05）。
　　②透射电镜结果显示，模型组大鼠胃黏膜上皮主细胞、壁细胞出现细胞核异形改变、核浆比增大、染色质异常，此外可见细胞核固缩、核碎裂形成、核间隙增宽、胞浆内大量空泡样变。另外，主细胞可见内质网数量明显减少、少量残存，壁细胞线粒体结构破坏、数量减少，微管泡结构破坏、或见部分管腔扩张。解毒方各组主细胞、壁细胞的病变程度较模型组相比具有一定程度改善，主要表现为细胞核浆比趋于正常、胞浆空泡样变减少、内质网结构数量部分恢复。
　　③正常胃黏膜上皮见Lgr5阴性表达或仅在胃黏膜隐窝底部见到少量散在的Lgr5+细胞。而模型组胃癌前病变大鼠胃黏膜上皮Lgr5+细胞数目显著增多，密集分布于胃黏膜上皮全层，Lgr5+细胞可能从胃黏膜隐窝底部“离巢”至上皮层。治疗组中可见Lgr5+细胞主要散在分布于胃黏膜上皮全层，Lgr5+细胞数目不同程度减少，以上变化以解毒方C组最为显著。数据显示，模型组胃癌前病变大鼠Lgr5蛋白表达较空白组显著增加（P＜0.01），解毒方能显著抑制胃癌前病变大鼠Lgr5蛋白过度表达(P＜0.05)。
　　④模型组GPL大鼠胃黏膜上皮细胞的C-myc mRNA表达水平较空白组显著增加(P＜0.01)。与模型组相比，解毒方各组大鼠C-myc mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）。与维酶素组相比，解毒方C组大鼠C-myc mRNA表达水平显著降低(P＜0.01)。与解毒方A、B组相比，解毒方C组大鼠C-myc mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)。
　　⑤模型组GPL大鼠胃黏膜上皮Wnt1蛋白表达水平较空白组显著增加(P＜0.05)。与模型组相比，解毒方各组大鼠Wnt1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01或P＜0.05）;与维酶素组相比，解毒方C组大鼠Wnt1蛋白表达水平显著降低(P＜0.05);而解毒方A、B组大鼠Wnt1蛋白表达水平则无显著性差异（P＞0.05）。
　　⑥模型组GPL大鼠胃黏膜上皮Wnt3a蛋白表达水平较空白组显著增加(P＜0.01)。与模型组相比，维酶素组、解毒方各组大鼠Wnt3a蛋白表达虽有下降趋势，但无显著统计学意义（P＞0.05）。
　　⑦模型组GPL大鼠胃黏膜上皮β-catenin蛋白表达水平较空白组显著增加(P＜0.01)。与模型组相比，维酶素组、解毒方各组大鼠β-catenin蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。与维酶素组相比，解毒方各组大鼠β-catenin蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)。
　　⑧模型组GPL大鼠胃黏膜上皮MMP-7蛋白表达水平较空白组显著增加(P＜0.01)。与模型组相比，解毒方C组大鼠MMP-7蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），而维酶素组及解毒方A、B组大鼠MMP-7蛋白表达水平虽有下降，但无显著统计学意义（P＞0.05）。与维酶素组相比，解毒方C组大鼠MMP-7蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），而解毒方A、B组大鼠MMP-7蛋白表达水平则无显著性差异（P＞0.05）。
　　结论:
　　①本次研究采用MNNG溶液自由饮用、饥饱失常法、小承气泻下耗气的综合造模方法，成功复制了胃癌前病变大鼠模型。
　　②解毒方能在一定程度上缓解GPL大鼠胃黏膜肠上皮化生、异型增生病变，改善GPL大鼠胃黏膜上皮主细胞、壁细胞的异常超微结构病变。
　　③胃癌前病变阶段胃黏膜病变时Lgr5+细胞可能不局限于隐窝底部，脱离正常微环境进而促进细胞异常分化、过度增殖，其“离巢”可能参与胃黏膜恶性转变过程。健脾化瘀解毒方可在一定程度上抑制Lgr5+细胞过度增殖。
　　④胃癌前病变阶段存在Wnt/β-catenin信号通路的失调，可能与Lgr5+细胞的早期离巢现象相关。解毒方可能通过抑制Wnt/Lgr5信号通路及相关靶因子异常激活状态，从而阻断甚至逆转胃癌前病变。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 胃癌前病变的西医学研究进展

1．1．1 胃癌与胃癌前病变

1．1．2 肠上皮化生的概念、分类、产生、发病率及预后

1．1．3 异型增生的概念、诊断、分级、发病率及预后

1．1．4 小结

2．1 胃癌前病变的中医学研究及健脾化瘀解毒方的干预优势

2．1．1 胃癌前病变的中医学概念、病因、病机

2．1．2 健脾化瘀解毒方的组方分析、前期研究

3．1 胃肿瘤干细胞及Wnt／Lgr5通路的研究进展

3．1．1 肿瘤干细胞相关学说

3．1．2 Wnt／β-catenin信号通路及其通路成员

3．1．3 小结

第二章 实验研究

1．1 健脾化瘀解毒方对GPL大鼠胃黏膜组织病理学及上皮细胞超微结构的影响

1．1．1 材料与方法

1．1．2 结果

1．1．3 讨论

1．1．4 小结

2．1 健脾化瘀解毒方对GPL大鼠胃黏膜上皮Wnt／Lgr5通路靶因子表达的影响

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果

2．1．3 讨论

2．1．4 小结

结语

参考文献

英文缩略语

在校期间发表论文情况

致谢