不同生长期穿心莲化学成分及相关酶活性变化规律的研究

摘要

穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees的干燥地上部分，是我国的大宗中药材，主产于华南地区，具有清热解毒、凉血、消肿的功效。穿心莲临床应用广泛，以穿心莲为主要配方的制剂有片剂、胶囊、注射剂等，消炎利胆片、复方穿心莲片等都是应用较多的名优药品。随着我国对穿心莲药材需求的日益增长，商业化种植模式已经逐渐形成。在中国的主产地广西，穿心莲药材的年产量在1万吨以上。然而，在种植过程中由于基因、环境、采收等的差异，穿心莲的质量一直不稳定。如何提高穿心莲中有效成分的含量，确保药材中有效成分的稳定性，是穿心莲质量评价一直面临的问题。本研究以穿心莲二萜内酯类成分为研究对象，对自然环境下不同生长期穿心莲中二萜内酯类成分和同工酶进行动态的监测，并进一步通过外源磷刺激，研究穿心莲内酯的累积和相关酶活性的变化，为探讨穿心莲二萜内酯类成分的生物合成机制奠定基础，为穿心莲的质量评价提供理论依据。
　　主要研究内容概述如下:
　　(1)不同生长期穿心莲叶和茎中二萜内酯类成分和同工酶的变化研究
　　考察了不同生长期穿心莲叶和茎的生物学特性、同工酶、二萜内酯类成分的变化。采用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）测定天冬氨酸转氨酶、苹果酸脱氢酶、过氧化物酶和过氧化氢酶4种同工酶酶谱的变化;利用HPLC-UV法，以穿心莲内酯、新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯为指标，测定二萜内酯类成分的累积情况。结果显示，不同生长期穿心莲叶片和茎中同工酶活性和穿心莲内酯含量的变化趋势相同，叶片中同工酶的活性和穿心莲内酯的含量均在花蕾初期达到最大值，茎中在花蕾期最高;叶片中去氧穿心莲内酯的含量在幼苗期最高，新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量在整个生长期一直处于波动状态，两个未知成分X1、X2和脱水穿心莲的变化趋势相反;茎中新穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量处于平缓的波动状态;穿心莲地上部分干重和四种二萜内酯类成分的总产量在始花期最高。说明天冬氨酸转氨酶、苹果酸脱氢酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性与穿心莲内酯的累积具有相关性，这4种酶可能参与穿心莲内酯的生物合成;二萜内酯类成分的总产量在始花期最高，建议穿心莲在始花期前后采收。
　　(2)不同产地穿心莲种子的同工酶酶谱研究
　　穿心莲进入果实成熟期后，收集广东、广西、福建产地的10批穿心莲种子，利用PAGE测定酯酶、酸性磷酸酯酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶的酶谱，并对这4种酶的酶谱进行相似度系数、遗传距离和聚类分析。10批不同产地穿心莲种子的酯酶、苹果酸脱氢酶、过氧化酶酶和酸性磷酸酯酶的多态位点百分率分别为66.7％、60％、33.3％和0;相似度系数介于0.667～1.000之间，遗传距离介于0.000～0.549之间;聚类分析结果显示广东省潮州市饶平县、广西省及福建省漳州市漳浦县和龙海市隆教乡的穿心莲种子可归为第Ⅰ类，广东省广州市从化、湛江市遂溪县、清远市大湾镇和福建省漳州市漳浦县前亭镇的穿心莲种子可归为第Ⅱ类，其中湛江市遂溪县的穿心莲种子又可单独分为一亚类。结果表明10批不同产地穿心莲种子间存在一定水平的遗传变异，湛江的穿心莲种子变异较明显。
　　(3)磷对不同生长期穿心莲中穿心莲内酯及相关酶的影响
　　采用土培盆栽的方法，设置空白、低磷、中磷和高磷4个处理水平，分析不同生长期穿心莲的生长状况，叶片和根中的含磷量、可溶性蛋白量、过氧化物酶和酸性磷酸酯酶的活性，以及叶片中穿心莲内酯含量及萜类代谢关键酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶和1-去氧木糖-5-磷酸还原酶活性。结果显示磷可以增加穿心莲的生物量，空白水平下穿心莲的根瘦弱，侧根增多;随着施磷水平的提高，叶片中穿心莲内酯的含量显著提高;不同磷水平下，叶片中的含磷量区别不大;叶片中可溶性蛋白含量随着磷加入量的升高而逐渐降低;过氧化物酶活性表现为随着磷水平的增高在植株生长前期呈增加趋势，后期活性逐渐降低，在同一磷水平下随着生长期的延长，过氧化物酶活性表现出先降低后升高的趋势;在较高磷水平下，与植物磷代谢相关的酸性磷酸酯酶活性较低，同一施磷水平下随着生长期的延伸，根中酸性磷酸酯酶的活性处于上升状态;穿心莲叶片中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶和1-去氧木糖-5-磷酸还原酶的活性整体上显著性增强，两种酶的活性变化趋势相同或者互补。说明磷可以通过改变相关酶的活性来促进穿心莲内酯的生物合成。

目录

声明

摘要

缩略词简表

引言

1 文献研究

1．1 穿心莲的资源分布

1．2 穿心莲研究现状

1．2．1 化学成分

1．2．2 药理作用

1．2．3 穿心莲质量评价的概况

1．3 同工酶技术

1．3．1 同工酶的定义

1．3．2 同工酶研究的基础

1．3．3 同工酶技术的应用

1．3．4 同工酶技术的研究方法

1．3．5 同工酶技术在穿心莲研究中的应用

1．4 本论文研究的目的、内容及实施方案

1．4．1 研究目的、内容

1．4．2 实施方案

2 不同生长期穿心莲二萜内酯类化学成分和同工酶的变化研究

2．1 仪器与试药

2．2 方法

2．2．1 生物学特性的测定

2．2．2 同工酶的测定

2．2．3 二萜内酯类成分的测定

2．3 结果与分析

2．3．1 生物学特性的变化

2．3．2 同工酶的变化

2．3．3 二萜内酯类成分的变化

2．4 讨论

2．5 小结

3 不同产地穿心莲种子的同工酶酶谱研究

3．1 仪器与试药

3．2 方法

3．2．1 粗酶液的提取

3．2．2 电泳

3．2．3 染色

3．2．4 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 不同产地穿心莲种子的同工酶酶带带特征

3．3．2 不同产地穿心莲种子的相似度系数

3．3．3 不同产地穿心莲种子的遗传距离

3．3．4 不同产地穿心莲种子的聚类分析

3．4 讨论

3．5 小结

4 磷对不同生长期穿心莲中穿心莲内酯及相关酶的影响

4．1 仪器与试药

4．2 方法

4．2．1 实验设计

4．2．2 生物量及根冠比的测定

4．2．3 穿心莲内酯含量测定

4．2．4 含磷量的测定

4．2．5 可溶性蛋白含量的测定

4．2．6 POD活性的测定

4．2．7 ACP活性的测定

4．2．8 HMGR和DXR活性的测定

4．3 结果与分析

4．3．1 磷对穿心莲生物量和根冠比的影响

4．3．2 磷对穿心莲内酯含量的影响

4．3．3 不同施磷水平下穿心莲含磷量的差异

4．3．4 磷对可溶性蛋白含量的影响

4．3．5 磷对POD活性的影响

4．3．6 磷对ACP活性的影响

4．3．7 磷对HMGR和DXR酶活性的影响

4．4 讨论

4．5 小结

结语

1 结论

2 展望

参考文献

附图

在校期间发表学术论文情况

致谢