血清刺激PI3K/AKT通路调控核仁转录及UBF1磷酸化

摘要

目的：
　　初步探讨PI3K/AKT通路在血清刺激宫颈痛HeLa细胞UBF1磷酸化及核仁转录中的调控作用。
　　方法：
　　通过Realtime PCR技术和Western Blot技术分别检测血清刺激和血清饥饿对细胞的核仁转录状态及UBF S388磷酸化、PI3K/AKT通路活化的影响;再分别用PI3K抑制剂及AKT抑制剂处理血清刺激的细胞以阻断相应通路，借助Realtime PCR技术、Western Blot技术和Luciferase Assay技术观察PI3K/AKT通路对血清刺激后的核仁转录、UBF S388磷酸化、核糖体基因(rDNA)启动子活性的影响;随后通过Western Blot实验和Luciferase Assay实验来比较PI3Kα抑制剂、PI3Kβ抑制剂及LY294002对HeLa细胞内PI3K/AKT通路的阻断作用、UBF S388磷酸化状态及rDNA启动子活性的影响。最后通过Western Blot技术和PI染色流式细胞术检测PI3K通路和Akt通路各自对下游mTORC1通路活化、周期蛋白cyclinE和cyclinA的蛋白水平及细胞周期的影响是否存在差异。
　　结果：
　　血清饥饿时，Pre-RNA合成量随着饥饿时间的延长而减少。UBF及P-UBF(S388)在饥饿24h时呈小幅度减少，且后者较前者减少更明显;超过24h二者又逐渐增加。AKT总量不变，P-AKT随时间减少;血清刺激后Pre-RNA合成量随着时间延长而增加。UBF的总量几乎无变化，P-UBF(S388)蛋白量则随着刺激时间延长而逐渐增加。AKT总量不变，P-AKT刺激后快速增加，维持至6h后又减少。
　　PI3K抑制剂LY294002处理组和AKT抑制剂处理组中，Pre-RNA合成量随时间延长不断减少，前者减少得更多。两种处理组Pre-RNA的减少在12h时有统计学意义差异;AKT总蛋白水平无明显变化，P-AKT蛋白在两种抑制剂作用时均逐渐减少，直至检测不到，且P AKT在LY294002处理组比AKT抑制剂处理组减少得更快;UBF和P-UBF在通路阻断后均减少，以LY294002处理组更显著。
　　PI3Kα抑制剂处理6h使UBF及P-UBF(S388)在大幅度减少，AKT及P-AKT(S473)亦呈时间梯度减少;而PI3Kβ抑制剂处理组时UBF及P UBF(S388)无明显减少，但AKT及P-AKT(S473)呈减少趋势;PI3KⅡ抑制剂、LY294002及AKT抑制剂均使启动子活性减少，以PI3Kα抑制剂组减少得最多，LY294002次之。AKT抑制剂组分别于PI3Kα抑制剂组、LY294002组进行组间比较，P值均小于0.05。PI3Kα抑制剂组与LY294002组比较得P值为0.772。
　　阻断PI3K通路后P-mTOR(S2448)显著减少，cyclinE蛋白量亦减少但cyclinA并未减少，HeLa细胞被停滞在S期;但阻断AKT通路后，P-mTOR(S2448)及周期蛋白cyclinE和cyclinA的蛋白总量均无明显变化，细胞被停滞在G2/M期。
　　结论：
　　血清刺激HeLa细胞使其核仁转录增加，伴PI3K/AKT通路激活和UBF活化;血清饥饿则呈时间梯度式抑制核仁转录、PI3K通路及UBF活化。PI3K/AKT通路，至少通过促进UBFS388磷酸化及提高rDNA启动子活性调控血清刺激后的核仁转录;在所有的PI3K激酶亚型中，ⅠA型PI3K在HeLa细胞中起主要作用。PI3K通路和AKT通路对血清刺激的UBF磷酸化及核仁转录的调控存在差异。血清刺激信号依赖于PI3K/mTORC1/cyclinE通路而非PI3K/AKT/mTORC1通路调控UBF磷酸化及核仁转录。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 血清刺激影响核仁转录及UBF活化

1．1 材料

1．1．1 试剂及耗材

1．1．2 仪器

1．1．3 实验所用细胞系

1．1．4 主要试剂和溶液的配制

1．2 实验方法

1．2．1 HeLa细胞株的培养

1．2．2 血清饥饿处理

1．2．3 血清刺激处理

1．2．4 Reverse Transcription PCR

1．2．5 Real-time PCR

1．2．6 Western blot实验

1．3 结果

1．3．1 血清饥饿对核仁转录及UBF活化影响

1．3．2 血清刺激对核仁转录及UBF活化影响

1．4 讨论

第二部分 PI3K／AKT通路参与血清刺激调控核仁转录

2．1 材料

2．1．1 主要试剂和耗材

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要溶液配制

2．2 实验方法

2．2．1 RT-PCR

2．2．2 Western blot实验

2．2．3 荧光素酶检测实验(Luciferase Assay)

2．3 结果

2．3．1 PI3K／AKT通路参与血清刺激调控核仁转录

2．3．2 PI3K／AKT通路参与调控血清刺激UBF磷酸化

2．3．3 ⅠA型PI3K参与核仁转录调控

2．3．4 PI3K／AKT通路调控rDNA启动子活性

2．4 讨论

第三部分 PI3K、AKT对核仁转录的调控有区别

3．1 材料

3．1．1 主要试剂和耗材

3．1．2 主要仪器

3．1．3 主要溶液配制

3．2 主要实验方法

3．2．1 Western Blot实验

3．2．2 流式细胞术检测细胞周期

3．3 结果

3．3．1 PI3K和AKT对下游调控不同

3．3．2 PI3K和AKT对下游cyclinE和cyclinA的调控不同

3．3．3 PI3K和AKT对细胞周期的调控不同

3．4 讨论

结语

参考文献

附录

综述 PI3K通路与UBF及核仁转录的研究进展

在校期间发表论文情况

致谢