参附注射液对LPS刺激的Tet-on-HMGB1过表达RAW264.7细胞HMGB1表达的影响

摘要

研究目的:
　　脓毒血症临床发病率和死亡率高居不下，预后不良，是急危重症医学面临的一大难题。脓毒血症严重影响生存质量，也带来了沉重的经济负担。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在内毒素休克晚期可以分泌出胞，加剧炎症级联瀑布反应，具有致死性毒性。因此，控制HMGB1的释放可能是控制炎症扩大的关键，HMGB1可作为防治脓毒血症的一个重要靶标。
　　参附汤组方实源自《伤寒论》四逆加人参汤，是扶阳固脱的典型代表方剂，临床上参附注射液(SF)广泛应用于治疗阳气暴脱“厥脱证”（休克），目前关于其对HMGB1表达的影响及机制探讨的报道较少。本研究将通过脂多糖(LPS)诱导Tet-on-HMGB1基因过表达的小鼠单核-巨噬细胞株RAW264.7建立炎症细胞模型，研究SF对LPS诱导的巨噬细胞HMGB1表达的影响，以期探索参附液注射液治疗脓毒血症的分子机制及中医扶正祛邪理论。
　　研究方法与内容:
　　1.以293T细胞为研究对象，将实验分为正常组、LPS组、正丁酸钠(SB)组、SF(8μ L/mL、12μ L/mL、14μ L/mL)组共六组，将HMGB1启动子质粒瞬转入细胞构建细胞HMGB1基因启动子驱动的荧光素酶(Luc)报告基因系统，正常组不做任何处理，LPS组用0.2μ g/mL LPS处理，药物组先使用0.2μ g/mL LPS预刺激0.5h后，再按分组给药24h。采用报告基因检测，分析SF对HMGB1启动子活性的影响。
　　2.以Tet-on-HMGB1基因过表达RAW264.7细胞株为研究对象，正常组、LPS组、正丁酸钠(SB)组、SF(8μL/mL、12μ L/mL、14μ L/mL)组共六组，以上各组给药前加入四环素(Tet)启动外源性HMGB1基因表达，随后正常组不做任何处理，LPS组用0.2μg/mL LPS处理，药物组先使用0.2μ g/mL LPS预刺激0.5h后，再按分组给药24h。
　　2.1.按照以上分组，各组分组给药后24h，提取mRNA，采用qRT-PCR法进行检测，分析SF对HMGB1 mRNA表达的影响。
　　2.2.按照以上分组，各组分组给药后24h，提取各组培养细胞总蛋白，采用western-blot检测HMGB1表达情况。用HMGB1抗体可以标记HMGB1蛋白、用flag抗体可以区别标记外源性HMGB1-flag蛋白。
　　2.3.按照以上分组，各组分组给药后24h，收集细胞上清液，用小鼠HMGB1 ELISAkit操作方法检测HMGB1在细胞上清的分泌表达量。
　　2.4.按照以上分组，细胞培养在载玻片上，各组分组给药后24h，通过细胞爬片进行免疫组化标记，用Cy3标记HMGB1抗体、Alexfluro488标记flag抗体孵育，于共聚焦显微镜下观察HMGB1在细胞内的表达位置。
　　研究结果:
　　1.HMGB1启动子荧光素酶报告基因检测结果显示，与空白组对比，LPS组细胞HMGB1启动子活性明显增强。与LPS组对比，SF各剂量组细胞HMGB1启动子活性减弱，提示SF能抑制HMGB1启动子的活性。
　　2.SF对LPS诱导的过表达细胞株HMGB1表达的影响。
　　2.1.qRT-PCR结果显示，与空白组对比，LPS组HMGB1 mRNA表达量显著升高;与LPS组对比，SF各剂量组HMGB1 mRNA表达明显下降，提示SF可以抑制HMGB1的转录。
　　2.2.western blot结果显示，与空白组对比，LPS组细胞HMGB1总蛋白、内源性HMGB1蛋白和外源性HMGB1-flag蛋白表达量均显著升高。与LPS组对比，SF各剂量组则明显下降。提示SF可以抑制HMGB1总蛋白、内源性HMGB1蛋白和外源性HMGB1-flag蛋白表达。
　　2.3.ELISA检测结果显示，与空白组对比，LPS组中细胞培养上清中HMGB1含量显著升高。与LPS组相比，SF各剂量组培养液上清中HMGB1含量含量明显下降，提示SF可以抑制HMGB1分泌出胞。
　　2.4.免疫荧光检测结果显示，在HMGB1过表达细胞株的正常组内，Cy3红色荧光标记的HMGB1、Alexfluro488绿色荧光标记的外源性HMGB1-flag和DAPI蓝色荧光标记的核三者重合。LPS刺激后红色荧光和绿色荧光弥散在胞质，SF给药后红色荧光和绿色荧光主要表达在胞核，少部分出现在胞质。提示SF可以抑制HMGB1蛋白从胞核转移到胞质。
　　研究结论:
　　1.SF可以降低HMGB1启动子的活性。
　　2.SF可以降低LPS诱导的HMGB1过表达细胞株HMGB1 mRNA表达量，减少细胞HMGB1总蛋白、内源性HMGB1蛋白、外源性HMGB1-flag蛋白的表达量，减少细胞培养上清中HMGB1的分泌含量。

目录

声明

摘要

引言

第一章 研究进展

第一节 脓毒血症的研究现状

第二节 HMGB1的研究现状

第三节 参附注射液的研究现状

第四节 研究思路

第二章 实验研究

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

实验二： 参附液对LPS刺激Tet-on-HMGB1过表达RAW264．7细胞HMGB1表达的影响

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

结语

参考文献

附录

攻读硕士学位期间科研成绩

致谢