穴位埋线对衰老模型大鼠海马自噬的影响

摘要

目的:
　　从行为学、形态学、分子生物学三个环节，通过观察大鼠一般状态、体重、旷场实验、水迷宫定位航行试验及空间探索试验，海马神经元HE染色、海马神经元尼氏染色、海马神经元透射电镜超微结构，海马神经元mTOR信号通路中ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA以及p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白等指标，从自噬角度阐明衰老的机制及慢性应激促进衰老的机理，为延缓衰老提供新的思路和理论依据;基于mTOR信号通路阐明穴位埋线影响复合衰老模型大鼠海马自噬功能的机制，为中医药延缓衰老的临床应用提供实验依据。
　　方法:
　　按照体重排序，采用SPSS17.0统计软件将实验动物随机分为组空白对照、模型一组（D-半乳糖腹腔注射）、模型二组（复合衰老模型）、穴位埋线组、假埋线组，每组12只。
　　空白对照组仅给予6周腹腔注射生理盐水。模型一组仅给予6周腹腔注射D-半乳糖（120mg/Kg/d）。模型二组给予6周腹腔注射D-半乳糖（120mg/Kg/d），同时从第3周开始给予慢性应激，共应激4周。穴位埋线组给予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d)，同时从第3周开始给予慢性应激，应激方式同模型二组，共应激4周。从第一周开始，每周埋线一次，共6次。假埋线组组给予6周腹腔注射D-半乳糖(120mg/Kg/d)，同时从第3周开始给予慢性应激，应激方式同模型二组，共应激4周。从第一周开始，每周假埋线一次，共6次。
　　埋线处方:选取“肾俞（双）”、“足三里（双）”、“百会”、“太冲（双）”作为穴位埋线处方。“肾俞（双）”、“百会（双）”一组，“太冲”和“足三里（双）”一组，两组交替埋线。
　　实验过程中，观察大鼠毛发饮食精神活动情况等一般状态。于实验前、3周后、实验结束（6周）后称量各组大鼠的体重。实验结束后，进行行为学实验——反映衰老大鼠自主活动能力的旷场实验及反映学习认知记忆能力的水迷宫实验。行为学结束后立马取材，通过HE染色及尼氏染色检测观察大鼠海马的一般病理形态结构;通过电镜检测观察海马的超微结构;qPCR法检测海马中ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA的表达;蛋白印记法(westernblot)检测海马中p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白的表达。
　　结果:
　　1.各组大鼠一般状态改变
　　模型一组、模型二组、假埋线组大鼠经过造模后，毛发凌乱晦暗、反应迟钝、精神倦怠少动、饮食量减少、耳廓无光泽，且模型二组、假埋线组老化现象更明显。穴位埋线组的老化现象得到明显改善。
　　2.各组大鼠体重结果
　　在造模期间，各组大鼠体重均有增长。空白对照组及模型一组的体重增长速度最快，穴位埋线组大鼠的体重增长较空白对照组缓慢，模型二组及假埋线组大鼠体重增长最慢。
　　3.各组大鼠旷场实验结果
　　与空白对照组相比，模型一组、模型二组、假埋线组大鼠旷场实验活跃度、中央区路程、中央区时间、总路程均减少(P＜0.05)，且模型二组及假埋线组较模型一组有升高或升高趋势。与模型二组相比，穴位埋线组大鼠旷场实验活跃度、中央区路程、中央区时间、总路程均增加(P＜0.05)
　　4.各组大鼠水迷宫实验结果
　　经过四天的定位航行试验训练，各组大鼠的逃避潜伏期均明显减少，其中空白对照组及穴位埋线组变化趋势最明显，模型一组次之，模型二组及假埋线组大鼠逃避潜伏期变化趋势最缓慢。在定位航行试验第四天，各组大鼠逃避潜伏期显示明显差异，与空白对照组相比，模型二组及假埋线组大鼠逃避潜伏期均升高(P＜0.05)，模型一组逃避潜伏期有升高趋势(P＞0.05);与模型一组相比，模型二组及假埋线组逃避潜伏期有升高趋势(P＞0.05);与模型二组相比，穴位埋线组大鼠逃避潜伏期降低(P＜0.05);与穴位埋线组相比，假埋线组大鼠逃避潜伏期升高(P＜0.01)。
　　与空白对照组相比，模型一组、模型二组及假埋线组穿越平台次数减少(P＜0.05);穴位埋线组穿越平台次数较之模型一组、模型二组及假埋线组有升高趋势(P＞0.05);模型一组、模型二组及假埋线组三组之间穿越平台次数进行两两比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　5.各组大鼠海马HE染色结果
　　空白对照鼠海马区神经元丰富，结构正常，细胞排列整齐紧密。模型一组、模型二组、假埋线组海马区神经元数目减少，排列紊乱，细胞间隙增大，细胞萎缩，且模型二组、假埋线组的病变程度比模型一组严重。穴位埋线组海马区神经元排列稍疏松，尚整齐，少量神经元萎缩，细胞数量无明显减少。
　　6.各组大鼠海马尼氏染色结果
　　空白对照组大鼠海马区神经元结构正常尼氏体清晰、丰富。模型一组、模型二组、假埋线组大鼠海马神经元排列紊乱，细胞间隙增大，尼氏体减少，且模型二组、假埋线组的病变程度比模型一组严重，尼氏体减少甚至消失。穴位埋线组大鼠海马区神经元排列还算整齐，但轻度疏松，细胞间隙稍增大，尼氏体清晰。
　　7.各组大鼠海马电镜超微结构结果
　　空白对照组大鼠海马CA1区神经元细胞核，线粒体、内质网、高尔基体等细胞器结构均正常有自噬小体的存在;未观察到脂褐素;突触体数量多且大，微管结构丰富。模型一组大鼠海马CA1区神经元细胞核异形，线粒体数量减少、肿胀变性;粗面内质网排列紊乱，甚至出现脱颗粒现象;自噬小体数量较之空白对照组明显增多;突触体数量减少，体积缩小，树突内微管和微丝结构存在溶解现象;脂褐素沉积增多。模型二组及假埋线组海马CA1区神经元超微结构损伤均较模型一组严重，自噬小体增多。穴位埋线组大鼠海马CA1区神经元形态结构大致正常，细胞核呈圆形，核膜完整，核仁明显，染色质数量多且分布均匀;线粒体数量尚可，偶有线粒体嵴不规则甚至消失，无空泡样变性;粗面内质网偶有脱颗粒现象;可见自噬小体;突触体结构数量基本正常，树突中微管微丝结构大致正常
　　8.各组大鼠海马ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA的表达结果
　　与空白对照组相比，模型一组海马LC3-Ⅱ、P62 mRNA表达升高(P＜0.05)，ULK1、Beclin1 mRNA的表达有升高趋势(P＞0.05);模型二组ULK1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA表达升高(P＜0.05)，Beclin1 mRNA的表达有升高趋势(P＞0.05)。与模型一组相比，模型二组海马LC3-Ⅱ mRNA、P62 mRNA表达升高(P＜0.05)，ULK1、Beclin1 mRNA的表达有升高趋势(P＞0.05)。与模型二组相比，穴位埋线组海马ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA表达均降低(P＜0.01)。与穴位埋线组相比，假埋线组海马ULK1、Beclin1mRNA、 LC3-Ⅱ、P62 mRNA表达升高(P＜0.05)。
　　9.各组大鼠海马p-mTOR、ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表达结果
　　与空白对照组相比，模型一组大鼠海马神经元P62、Beclin1蛋白的表达有升高趋势(P＞0.05)，LC3-Ⅱ、ULK1蛋白表达升高（P＜0.05），p-mTOR表达降低（P＜0.01）;模型二组LC3-Ⅱ、P62、ULK1、Beclin1蛋白表达均升高(P＜0.05)，p-mTOR表达降低(P＜0.01)。与模型一组相比，模型二组大鼠海马神经元ULK1、P62、Beclin1、P62蛋白表达升高(P＜0.05)，p-mTOR蛋白的表达有降低趋势(P＞0.05)。与模型二组相比，穴位埋线组大鼠海马神经元ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表达均降低(P＜0.05)，p-mTOR表达升高P＜0.05）;假埋线组大鼠海马神经元ULK1、Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 mRNA表达则无明显差异。
　　结论:
　　1.D-半乳糖致衰模型大鼠和复合衰老模型大鼠在一般状态、自主活动能力、学习认知能力、海马的一般病理组织学结构以及超微结构等方面都出现了衰老变化，自噬的活性下降，而慢性应激可使D-半乳糖致衰模型大鼠的以上行为学、形态学、分子生物学方面的衰老改变更加严重，说明复合衰老模型大鼠的模型建立成功。
　　2.穴位埋线对复合衰老模型大鼠的行为学，包括一般状态、反映自主活动能力的旷场实验、反映学习认知记忆能力的水迷宫实验都有改善作用。
　　3.穴位埋线可以改善复合衰老模型大鼠海马神经元的一般病理组织学结构以及超微结构。
　　4.穴位埋线通过抑制海马神经元异常亢奋的自噬启动及自噬小体形成、恢复自噬溶酶体的清除降解功能常，修复完整自噬流，清除海马神经元内错误折叠蛋白或者受损老化的细胞器，使海马神经元恢复正常的生理活动，延缓海马的衰老进程。
　　总之穴位埋线通过抑制海马神经元异常亢奋的自噬启动及自噬小体形成、恢复自噬溶酶体的清除降解功能常，修复完整自噬流，使大鼠的海马一般病理组织形态及超微结构得以改善，功能得以恢复，从而使大鼠的学习认知记忆能力恢复正常，抗应激损伤，延缓衰老的进程。

目录

声明

摘要

第一章 文献研究

第一节 中医学对衰老的研究

一、中医学中影响衰老的因素

二、中医学中衰老的相关学说

三、中医学种延缓衰老的原则

第二节 现代医学衰老机制概述

一、环境伤害理论

二、遗传衰老理论

第三节 慢性应激与海马自噬在衰老中的作用

一、慢性应激与海马老化

二、自噬与海马老化

三、衰老进程中慢性应激与海马自噬的关系

四、自噬的核心分子机制

第四节 针灸延缓机制研究

一、针灸延缓衰老作用机制

二、延缓衰老的常用腧穴

第五节 衰老的动物模型研究进展及选择

一、自发性衰老动物模型

二、诱发性衰老动物模型

三、基因工程衰老动物模型

四、衰老动物模型的选择

第二章 实验研究

第一节 穴位埋线对复合衰老大鼠一般行为学及学习记忆能力的影响

一、实验材料与方法

二、实验结果

三、讨论

四、小结

一、实验材料与方法

二、实验结果

三、讨论

四、小结

第三节 穴位埋线对复合衰老大鼠海马自噬相关基因的影响

一、实验材料与方法

二、实验结果

三、讨论

四、小结

一、实验材料与方法

二、实验结果

三、讨论

四、小结

结语

参考文献

在校期间发表论文情况

附图

致谢