降糖三黄片对糖尿病肾病大鼠TLR4/NF-κB信号通路的研究

摘要

文献研究:
　　糖尿病肾病与消渴病日久并发的“下消”、“肾消”等相关。病因与先天禀赋不足、饮食不节、房劳过度、情志失调等因素有关，病机以脾胃亏虚、肾阴不足为本，以燥热、痰饮、水湿、瘀血、浊毒为标。治疗以补肾健脾，滋阴清热为大法，佐以化痰利水、活血化瘀、泻浊通腑之法。现代医学认为糖尿病肾病的发生涉及多种因素，如晚期糖基化终末产物蓄积、蛋白激酶C活化、多元醇通路激活、脂代谢紊乱、高血压、细胞因子等。近年来，越来越多的研究表明炎症反应在糖尿病肾病的发病机制中占据重要地位，TLR4/NF-κ B通路是介导炎症反应的重要信号通路，TLR4能激活NF-κB，增加炎症因子的表达，促进糖尿病肾病的进展。降糖三黄片是以桃核承气汤加减研制而成的院内制剂，具有益气养阴，活血化瘀，泻热通腑的功效，在防治糖尿病肾病方面具有一定疗效。
　　实验研究:
　　目的:
　　探究降糖三黄片对糖尿病肾病大鼠肾组织TLR4/NF-κ B信号通路的影响，观察由TLR4/NF-κ B信号通路诱导的MCP-1的表达，探讨降糖三黄片对糖尿病肾病的保护作用及机制。
　　方法:
　　80只SPF级SD大鼠经适应性喂养1周后，按随机数字表分为正常组10只，造模组70只。造模前大鼠需禁食12小时，不禁水，造模组按45mg/kg剂量腹腔内注射STZ，正常组腹腔内注射等量的柠檬酸缓冲液。造模72小时后，测大鼠空腹血糖，若血糖值＞16.7mmol/L，确认为糖尿病模型。正常组大鼠给予普通饲料进行喂养，造模组大鼠给予高糖高脂饲料进行喂养，继续喂养3周。3周后测尿液，尿量＞原尿量的150％、24小时尿蛋白＞30mg/24h，则确认为糖尿病肾病模型。糖尿病肾病模型造模成功的大鼠按随机数字表进一步分为模型组12只、降糖三黄片低剂量组11只、降糖三黄片中剂量组11只、降糖三黄片高剂量组11只、厄贝沙坦组11只。降糖三黄片低剂量组按675mg/kg·d的剂量灌胃，降糖三黄片中剂量组按1350mg/kg·d的剂量灌胃，降糖三黄片高剂量组按2700mg/kg·d的剂量灌胃，厄贝沙坦组按13.5mg/kg·d的剂量灌胃，灌胃前药物均用纯净水配成2ml混悬液，每日1次灌胃，连续8周。正常组及模型组灌服等量蒸馏水。实验结束时共62只大鼠完成实验，其中正常组10只，模型组9只，降糖三黄片低剂量组10只，降糖三黄片中剂量组11只，降糖三黄片高剂量组11只，厄贝沙坦组11只。分别在造模72小时后及治疗前测大鼠尾尖空腹微量血糖。治疗前及治疗8周后收集24h尿液测尿蛋白。治疗8周后，每只大鼠予腹腔注射10％水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，检测空腹血糖、糖化血红蛋白、总甘油三脂、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、血肌酐、血尿素氮等指标。免疫组化法检测各组肾组织中TLR4、NF-κ B(p65)、MCP-1蛋白的分布，Western blot法检测各组肾组织中TLR4、NF-κ B(P-p65)、MCP-1蛋白的表达。
　　结果:
　　1.治疗8周后降糖三黄片低、中、高剂量组空腹血糖与模型组相比显著下降（P＜0.01）;厄贝沙坦组空腹血糖与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组相比，降糖三黄片低、中、高剂量组糖化血红蛋白均明显下降（P＜0.01）;厄贝沙坦组糖化血红蛋白与模型组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。降糖三黄片低、中、高剂量组TG、TC、LDL-C与模型组相比显著降低(P＜0.01)。降糖三黄片低、中、高剂量组HDL-C与模型组相比显著升高，有统计学差异（P＜0.01）。厄贝沙坦TG、TC、LDL-C、HDL-C与模型组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。降糖三黄片低、中、高剂量组、厄贝沙坦组相对肾重与模型组相比显著减轻（P＜0.01）。治疗8周后，降糖三黄片低、中、高剂量组及厄贝沙坦组24h尿蛋白与模型组相比显著减少（P＜0.05)。治疗8周后，降糖三黄片高剂量组24h尿蛋白与厄贝沙坦组相比无统计学差异（P＞0.05）。降糖三黄片低、中、高剂量组、厄贝沙坦组血肌酐、血尿素氮与模型组相比显著降低(P＜0.05)。降糖三黄片高剂量组血肌酐、血尿素氮与厄贝沙坦组相比显著降低(P＜0.01)。
　　2.TLR4、NF-κ B(p65)免疫组化染色结果显示，降糖三黄片低、中、高剂量组、厄贝沙坦组TLR4平均光密度值与模型组相比显著降低（P＜0.05)。降糖三黄片高剂量组TLR4平均光密度值与厄贝沙坦组相比无统计学差异（P＞0.05）。降糖三黄片低、中、高剂量组、厄贝沙坦组NF-κ B(p65)平均光密度值与模型组相比显著降低（P＜0.01)。降糖三黄片高剂量组NF-κB(p65)平均光密度值与厄贝沙坦组相比无统计学差异(P＞0.05）。Western blotting法检测TLR4、NF-κ B(p65)蛋白表达显示，降糖三黄片低、中、高剂量组、厄贝沙坦组与模型组相比TLR4蛋白表达量显著下降（P＜0.01）。降糖三黄片高剂量组TLR4蛋白表达量与厄贝沙坦组相比无统计学差异（P＞0.05）。降糖三黄片低、中、高剂量组、厄贝沙坦组NF-κ B(P-p65)蛋白表达量与模型组相比显著降低（P＜0.01）。降糖三黄片高剂量组NF-κ B(P-p65)蛋白表达量与厄贝沙坦组相比，无统计学差异（P＞0.05）。
　　3.MCP-1免疫组化染色结果显示，降糖三黄片低、中、高剂量组、厄贝沙坦组MCP-1平均光密度值与模型组相比显著降低（P＜0.05)。降糖三黄片高剂量组MCP-1平均光密度值与厄贝沙坦组相比无统计学差异（P＞0.05）。Western blotting法检测MCP-1蛋白表达显示，降糖三黄片低、中、高剂量组、厄贝沙坦组MCP-1蛋白表达量与模型组相比显著降低（P＜0.01）。降糖三黄片高剂量组MCP-1蛋白表达量与厄贝沙坦组相比，无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　降糖三黄片能改善糖、脂代谢，减少尿蛋白的排泄，改善肾功能。降糖三黄片低、中、高剂量组间存在一定的量效关系，以降糖三黄片高剂量组效果最佳。降糖三黄片通过抑制TLR4/NF-κ B炎症信号通路，下调炎症因子MCP-1的表达，起到减轻肾小球肥大、减少尿蛋白排泄，保护肾功能的作用，延缓DN的发生发展。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 中医学对糖尿病肾病的认识

一、病因病机

二、辨证论治

第二节 现代医学对糖尿病肾病的认识

一、糖尿病肾病的发病机制

二、TLR4／NF-κ B通路与糖尿病肾病

第三节 降糖三黄片与糖尿病肾病

第二章 实验研究

三、结果

四、讨论

实验二 降糖三黄片对糖尿病肾病大鼠TLR4／NF-κ B信号通路的影响

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

实验三 降糖三黄片对糖尿病肾病大鼠MCP-1表达的影响

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢