老年大鼠GnRH1表观变化及琼玉膏延缓衰老的分子机制探讨

摘要

目的:
　　通过对老年大鼠与青年大鼠下丘脑衰老相关基因GnRH1、Sirt1、DNMT1、DNMT3amRNA和蛋白表达水平以及GnRH1基因甲基化情况进行分析，从表观遗传水平探讨大鼠自然衰老进程中DNA甲基转移酶活性及GnRH1基因甲基化的改变;通过分离新生大鼠下丘脑神经元干细胞，建立D-半乳糖诱导的下丘脑神经元干细胞衰老模型，比较正常神经元干细胞组、D-半乳糖诱导衰老组与不同浓度琼玉膏干预组之间细胞成球能力、炎性因子及NF-κB表达的差异，为揭示琼玉膏延缓神经元干细胞衰老的功效及其可能分子机制提供实验参考和数据支持。
　　方法:
　　观察比较6只24月龄自然衰老SD大鼠和6只2月龄青年SD大鼠下丘脑衰老相关基因mRNA和蛋白表达水平:Real-Time PCR检测GnRH1、Sirt1、DNMT1、DNMT3a基因mRNA表达水平;Western Blot检测GnRH1、Sirt1、DNMT1、DNMT3a蛋白表达水平;使用SPSS19.0统计软件做统计学分析。MSP法检测老年大鼠和青年大鼠GnRH1基因甲基化情况。
　　分离培养8只新生SD大鼠（出生24h内）下丘脑神经元干细胞，免疫荧光法检测神经元烯醇化酶(NSE)，鉴定神经元干细胞;CCK8法检测琼玉膏对神经元干细胞增殖的影响（OD值），使用SPSS19.0统计软件计算IC50，为后续分组实验提供依据。取神经元干细胞分成A、B、C、D四组，采用NSCs完全培养基分别对四组进行原代培养至第8天;从第9天起，A组继续采用培养基培养24h;B组依据参考文献加入10mg/mLD-半乳糖致衰24h;C组先加90μg/mL(1/2 IC50)琼玉膏干预6h，再加10mg/mL D-半乳糖致衰24h;D组先加45μg/mL(1/4 IC50)琼玉膏干预6h，再加10mg/mL D-半乳糖致衰24h。倒置荧光显微镜下观察各组神经元干细胞形态及成球能力(SFE);Real-Time PCR检测各组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素1β(IL-1β)mRNA表达水平;Western Blot检测核转录因子-kappaB(NF-κB)蛋白表达水平;Elisa检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素1β(IL-1β)蛋白表达水平;使用SPSS19.0统计软件做统计学分析。
　　结果:
　　1.GnRH1、Sirt1、DNMT1基因mRNA及蛋白表达水平在老年鼠中明显降低，与青年鼠比较有显著性差异(p＜0.05); DNMT3a基因mRNA及蛋白表达水平在老年鼠和青年鼠之间无显著性差异(p＞0.05);老年鼠GnRH1基因出现部分甲基化，青年鼠GnRH1基因未出现甲基化。
　　2.从新生鼠下丘脑成功分离神经元干细胞，倒置显微镜下观察细胞成球状生长;免疫荧光法检测到细胞球体有NSE清晰的红色荧光信号，即NSE在神经元干细胞中阳性表达。
　　3.CCK8法检测到琼玉膏对神经元干细胞的增殖作用（OD值）与时间和剂量存在一定的依赖关系，24h内琼玉膏浓度变化对细胞的影响较小;根据24h对应的IC50值(185.91μg/mL)，选取1/2 IC50(90μg/mL)和1/4 IC50(45μg/mL)作为后续分组实验时琼玉膏的浓度值。
　　4.成功建立D-半乳糖诱导的下丘脑神经元干细胞衰老模型，呈现典型的炎症样变化:细胞成球能力降低，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素1β(IL-1β)mRNA和蛋白表达水平显著增加，核转录因子-kappaB(NF-κB)信号通路被激活，cytoplasmP65表达水平下降，nuclear P65表达水平上升。
　　5.90μg/mL(1/2 IC50)琼玉膏干预组与D-半乳糖衰老模型组比较细胞成球能力显著恢复(p＜0.05)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素1β(IL-1β)mRNA和蛋白表达水平显著降低(p＜0.05)，核转录因子-kappaB(NF-κ B)转录活性被抑制，cytoplasm P65表达水平上升，nuclear P65表达水平下降。
　　结论:
　　1.GnRH1、Sirt1基因mRNA及蛋白表达水平在老年鼠和青年鼠之间有显著性差异，说明GnRH1、Sirt1的表达水平与增龄呈负相关。
　　2.DNMT1基因mRNA及蛋白表达水平在老年鼠中显著降低，DNMT3a基因mRNA及蛋白表达水平在老年鼠和青年鼠之间无显著性差异，说明DNMT1的表达水平与增龄呈负相关，DNMT3a的表达水平不随增龄而变化。
　　3.GnRH1基因在老年鼠中出现部分甲基化，在青年鼠中未出现甲基化，说明GnRH1基因的表达水平受到其启动子区甲基化的调控，大鼠机体发生自然衰老与GnRH1基因启动子甲基化从而抑制GnRH1的表达水平有关。
　　4.琼玉膏能预防D-半乳糖诱导的神经元干细胞衰老模型的炎症反应:恢复细胞成球能力、抑制炎性指标，且其作用强度呈浓度依赖性，随着琼玉膏浓度从45μg/mL增加到90μg/mL，其延缓衰老作用也相应增强。
　　5.由于NF-κB具有负调控GnRH1基因mRNA表达的功能，因此琼玉膏延缓衰老作用的可能分子机制在于抑制下丘脑神经元干细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的表达以及NF-κB的转录活性，进而逆转自然衰老进程中GnRH1基因甲基化及其mRNA表达水平的下降。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献研究

第一节 表观遗传学的研究进展

一、表观遗传学概述

二、表观遗传学的调控机制

三、表观遗传学与中医学

四、表观遗传学与衰老

第二节 琼玉膏延缓衰老的研究进展

一、琼玉膏延缓衰老的文献记载

二、琼玉膏延缓衰老的现代研究

三、结合基因表观变化探讨琼玉膏延缓衰老的意义

一、技术路线

二、主要研究内容

三、可行性分析

四、创新性

第二部分 实验研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

第二节 琼玉膏延缓神经元干细胞衰老的分子机制研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

第三部分 讨论

第一节 老年大鼠GnRH1表观变化分析

第二节 琼玉膏在细胞水平延缓衰老的分子机制探讨

第四部分 展望

第一节 衰老相关因素探究与展望

一、年龄与衰老

二、基因与衰老

三、环境与衰老

第二节 琼玉萃取液研发依据与设想

三、科学萃吃——高效养生

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢