基于线粒体的结构和功能探讨三味干姜散保肝作用及其入血成分研究

摘要

目的:
　　本课题从保护肝脏线粒体结构和功能的角度出发，复制酒精性肝损伤模型和ConA免疫性肝损伤模型，探讨三味干姜散的保肝机制，并研究其入血成分，为三味干姜散的临床应用奠定物质基础。
　　方法:
　　1.将72只SD大鼠随机分为正常组、酒精模型组、水飞蓟素阳性组、三味干姜散高、中、低剂量干预组。除正常组以外，各组上午灌胃55％酒精，下午灌胃相应药物，连续10d，正常组灌胃相应剂量的蒸馏水，制备酒精性肝损伤大鼠模型，在末次给药12h以后，2％戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，分离的血清用于检测肝功指标ALT、AST，肝脏用于HE切片染色进行病理观察，提取的肝脏线粒体用于检测线粒体膜电位、膜通透性、SOD、8-OHdG、呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅲ;制备肝匀浆检测MDA、GSH、GSH-Px，RT-PCR检测肝细胞中Nrf2、Bach1和HO-1 mRNA的表达;Western Blot检测肝组织中Nrf2、Bach1以及HO-1蛋白的表达水平。
　　2.将72只KM小鼠随机分为正常组、ConA模型组、水飞蓟素阳性组、三味干姜散高、中、低剂量干预组。除正常组以外，各组每天灌胃相应体积药物1次，连续7d，正常组灌胃等体积的蒸馏水，在末次给药以后12h，除正常组外，其余各组尾静脉注射ConA25mg/kg，制备ConA免疫性肝损伤模型。造模4h后眼球取血，分离出的血清用于检测肝功指标ALT、AST，分离的肝脏用于HE切片染色进行病理学观察，提取的肝脏线粒体检测线粒体膜电位、SOD、8-OHdG，制备肝匀浆测定MDA、GSH、GSH-Px。
　　3.通过超高效液相-质谱联用仪测定，并建立三味干姜散化学成分信息库，利用Peakview软件对三味干姜散含药血清、空白血清、单复方化合物成分进行筛查，以6-姜酚对照品，以期寻找三味干姜散入血成分。
　　结果:
　　1.用55％酒精给SD大鼠灌胃造模10天后，发现酒精模型组血清中的ALT、AST水平升高（P＜0.01）;HE切片染色病理观察结果表明，酒精模型组肝小叶之间的界限不是很清晰，肝细胞索发生紊乱，肝窦范围变窄，肝细胞也浊肿，而胞质出现疏松，淡染，更有大部分的肝细胞出现肿胀，呈现出气球样的病变。酒精模型组的荧光强度比值下降，表明JC-1单体增多，膜电位△ψm下降(P＜0.05)，在10min以内A540值迅速下降，△A540值上升明显（P＜0.05），表明线粒体容积增大，光散射性下降。SOD酶活性显著下降（P＜0.01），GSH-Px酶活性显著下降(P＜0.01)，GSH活性下降(P＜0.05);MDA活性显著增加(P＜0.01)，8-OHdG含量显著增加（P＜0.01）;
　　2.呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ酶活性显著性降低(P＜0.01);肝组织中的Nrf2、Bach1、HO-1 mRNA的表达水平提高，其中Nrf2、HO-1 mRNA表达水平(P＜0.05)，Bach1mRNA表达水平(P＜0.01)。三味干姜散干预组肝细胞水肿症状均有不同程度缓解，三昧干姜散高剂量能降低血清中ALT水平(P＜0.05)，能升高SOD酶活性(P＜0.05)，升高GSH-Px酶活性(P＜0.05)，能增加GSH酶活性(P＜0.01)，10min内△A540下降(P＜0.05)，能降低8-OHdG含量（P＜0.01），降低MDA活性(P＜0.01)，能显著增加呼吸链复合物Ⅲ酶活性（P＜0.01），增加呼吸链复合物Ⅰ(P＜0.05)，能上调Nrf2和HO-1 mRNA的表达(P＜0.05);中剂量能降低血清中ALT、AST水平(P＜0.05);能增加GSH酶活性(P＜0.01)，能显著降低8-OHdG含量(P＜0.01)、降低MDA活性(P＜0.05)，能显著增加呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ酶活性(P＜0.01);低剂量组能降低MDA活性和8-OHdG含量(P＜0.05)，增加呼吸链复合物Ⅲ酶活性(P＜0.05)。
　　2.尾静脉注射ConA造模后，发现模型组小鼠血清中ALT、AST水平显著上升(P＜0.01);HE切片染色病理学观察发现，模型组的肝细胞发生水肿，有的充血坏死，肝小叶结构也受到破坏，严重的还出现小灶样坏死以及炎症细胞浸润，汇管区被大量炎性细胞所浸润。模型组的荧光强度比值下降，表明JC-1单体可能增多，膜电位△ψm明显下降(P＜0.05)，并且在10min以内A540值迅速下降，△A540值明显上升(P＜0.05)，表明线粒体容积可能增大，光散射性下降;SOD酶、GSH-Px酶活性显著下降(P＜0.01)，GSH活性下降（P＜0.01）;MDA活性显著增加(P＜0.05)，而8-OHdG含量却显著增加（P＜0.01）;在病理观察中，三味干姜散干预组对于模型组出现的肝细胞状况都有着不同程度缓解，其中高剂量组能显著降低血清中的ALT、AST的含量水平（P＜0.01），能升高SOD酶活性（P＜0.05），升高GSH-Px、GSH酶活性(P＜0.01)，能降低8-OHdG含量(P＜0.01)，降低MDA活性(P＜0.01);中剂量组的荧光强度比值增加，表明JC-1聚合物可能增多，膜电位△ψm明显上升(P＜0.01)，还能增加GSH-Px酶活性（P＜0.05），能降低8-OHdG含量（P＜0.01）;低剂量能升高GSH酶活性(P＜0.05)。
　　3.以6-姜酚作为对照品，对空白血清、三昧干姜散含药血清、复方以及单方进行检测，发现6-姜酚在含药血清、三味干姜散复方以及干姜单方中的保留时间基本一致，其在二级质谱图中的特征碎片峰基本一致，提示6-姜酚可能是以原型入血。
　　结论:
　　1.三味干姜散的保肝作用与其对肝脏线粒体的保护有关，具体表现为保护线粒体的膜结构、提高抗氧化酶的数量，减轻DNA的氧化损伤以及恢复线粒体的氧化还原系统，调控内源性抗氧化系统，减轻机体脂质抗氧化反应，上调Nrf2、Bach1以及HO-1基因和蛋白的表达。
　　2.经过UPLC-MS法检测得出6-姜酚可能是三味干姜散的入血成分，并以原型入血。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

1．1 急性肝损伤

1．2 线粒体的结构和功能及其损伤机制

1．3 三味干姜散

1．4 血清药物化学

第二章 三味干姜散对急性酒精性肝损伤大鼠肝脏线粒体的作用

1 材料与仪器

1．1 药物与试剂

1．2 仪器

1．4 主要药物及试剂的配制

2 实验方法

2．1 复制大鼠急性酒精性肝损伤模型及给药方法

2．2 样本采集

2．3 指标测定

2．4 统计学分析方法

3 结果

3．1 三味干姜散对急性酒精性肝损伤模型动物一般状态及体重的影响

3．2 三味干姜散对急性酒精性肝损伤大鼠血清肝功能影响

3．3 三味干姜散对急性酒精性肝损伤大鼠肝脏病理学观察

3．4 三味干姜散对急性酒精性肝损伤大鼠线粒体结构的影响

3．5 三味干姜散对急性酒精性肝损伤大鼠肝脏抗氧化系统的影响

3．6 三味干姜散对急性酒精性肝损伤大鼠肝脏线粒体呼吸链复合物的影响

3．7 急性酒精性肝损害模型中各指标之间的相关性分析

4 讨论

4．1 酒精性肝损伤模型的评价

4．2 酒精性肝损伤对肝线粒体结构和功能的影响

4．3 三味干姜散对酒精性肝损伤大鼠的影响

4．4 急性酒精性肝损伤大鼠各指标之间的相关性分析

5 小结

第三章 三味干姜散对免疫性肝损伤小鼠肝脏线粒体的作用研究

1 材料与仪器

1．1 药物与试剂

1．2 仪器

1．3 实验动物

1．4 主要药物及试剂的配制

2 实验方法

2．1 小鼠免疫性肝损伤模型复制及给药方法

2．2 样本采集

2．3 指标测定

3 结果

3．1 三味干姜散对实验性ConA肝损模型动物一般状态及体重的影响

3．2 三味干姜散对免疫性肝损伤小鼠血清肝功能影响

3．3 三味干姜散对免疫性肝损伤小鼠肝脏病理学观察

3．4 三味干姜散对免疫性肝损伤小鼠线粒体膜结构的影响

3．5 三味干姜散对免疫性肝损伤小鼠肝脏抗氧化系统的影响

3．8 ConA免疫性肝损伤小鼠的各项指标的相关性分析

4 讨论

4．1 ConA免疫性肝损伤模型的评价

4．2 ConA免疫性肝损伤对肝线粒体结构和功能的影响

4．3 三味干姜散对ConA免疫性肝损伤小鼠的影响

4．4 ConA诱导的免疫性肝损伤小鼠中各指标的相关性分析

5 小结

第四章 三味干姜散入血成分研究

1 材料与仪器

1．1 药物与试剂

1．2 仪器

2 实验方法

2．1 对照品溶液的制备

2．2 含药血清的制备

2．3 三味干姜散含药血清供试品溶液的制备

2．4 色谱条件

2．5 质谱条件

2．6 方法学考察

3 结果

3．1 流动相优化

3．2 前处理方法的选择

3．3 入血成分分析

3．5 方法学考察

4 讨论

4．1 三味干姜散含药血清前处理方法的选择

4．2 仪器方法的选择

4．3 三味干姜散含药血清中成分溶出情况

5 小结

结语

参考文献

附录

在校发表论文情况

致谢