木麻黄林地微生物次生代谢产物及真菌群落结构多样性分析

摘要

木麻黄的化感作用对植株生长和林木更新产生重要的影响，近年来木麻黄化感物质的来源、化感作用途径和化感物质的分类等被大量的研究。关于化感物质来源的研究大多集中于木麻黄植株本身，土壤微生物作为木麻黄林地微环境的重要组成成分，不仅具有丰富的种类，而且其次生代谢产物也相当丰富，是木麻黄林地化感物质来源中一个重要的不可忽略的方面。因此本文对木麻黄林地所鉴定出的不同林龄的差异性细菌和真菌次生代谢产物进行分析，通过GC-MS技术对不同林龄差异性菌种的发酵液浸提液进行鉴定，并且对所鉴定出来的物质种类和含量进行分析，将菌体发酵液所鉴定出来的物质与前期所鉴定出来的木麻黄根、凋落物、土壤浸提液所鉴定出来的物质成分进行对比分析。为了探究木麻黄林地差异性土壤微生物的化感潜力，用不同种类的菌体发酵液对乡土树种青皮、红厚壳和杨叶肖槿进行处理，探究其种子萌发率的差异，从而探究不同菌体发酵液对同一乡土树种化感潜力的差异及同一菌体发酵液对不同树种化感潜力的影响。对物质合成过程中的主要酶类进行实时荧光定量PCR，探究在物质合成过程中不同酶类的表达量差异。为了更好的探究木麻黄林地微生物菌群的群落结构多样性，本文通过PE250测序平台进一步对木麻黄林地真菌群落结构多样性进行分析，以期更好地了解木麻黄林地土壤微环境，为木麻黄林的更新和保护提供更多的理论依据。本文主要研究结果如下：
　　1.GC-MS鉴定结果表明，不同林龄木麻黄林地差异木麻黄林地特有细菌和真菌的次生代谢产物所鉴定出来的物质主要为酸、酯、烷、醛、酮、酰胺、酚类、醚类、吡喃、吡啶等有机化合物，不同菌种所鉴定出来的物质种类和含量存在差异。采用甲醇作为萃取剂共萃取出100余种物质比采用正己烷作为萃取剂所鉴定出来的物质更为丰富。木麻黄林地土壤特有细菌代谢产物中与木麻黄土壤、根、凋落物的共有物质有5种，分别为2,4-二叔丁基苯酚、硬脂酸甲酯、1,2,3,4-丁四醇、甘油醚和苯并吡喃，并且存在部分特有物质。木麻黄林地特有真菌代谢产物中与木麻黄壤、根、凋落物的共有物质也有5种，分别为2,4-二叔丁基苯酚、硬脂酸甲酯、棕榈酸甲酯、2,4,7,9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇、二苯砜，和细菌次生代谢产物具有部分物质重叠。
　　2.不同来源的菌种发酵液对青皮、红厚壳和杨叶肖槿种子萌发率较对照组均有明显的抑制作用，延长了种子萌发时间，三种乡土树种的发芽率、绝对发芽率、绝对发芽势和化感效应指数均受到了抑制作用。三种乡土树种中青皮种子的受抑制作用最强，杨叶肖槿次之，红厚壳最弱，说明不同乡土树种在面对外界环境作用时耐受性不同，因此受影响程度也存在差异。在细菌菌体发酵液中对种子萌发抑制作用最强的是无花果沙雷氏菌，在真菌中对种子萌发抑制作用最强的是日本曲霉原变种，分析其原因可能是此两种菌液中所含有的具有化感潜力的物质较多，具有较强的化感抑制作用。
　　3.无花果沙雷氏菌为木麻黄中龄林特有的差异性细菌，其次生代谢产物硬脂酸甲酯在发酵液浸提液和木麻黄林土壤浸提液中共同含有，因此推测该物质经由微生物代谢合成之后经过转化作用进入土壤。在硬脂酸甲酯合成过程中涉及到的主要酶类实时荧光定量PCR结果表明，不同酶类的相对表达量存在差异，乙酰CoA酶类中相对表达量最高的是乙酰CoA羧化酶A(accA)；酰基转移酶类中相对表达量最高的是β-羟脂酰ACP脱水酶（fabZ）。
　　4.通过PE250测序平台测序后，在97％的序列相似度下对序列进行归类，对照组的OTU最为丰富，随着林龄增加OTU数量表现出随林龄增长而增加的趋势。不同林龄聚类树和柱状图组合分析表明，裸地对照和不同林龄样品之间差异较大单独分为一类，相对于中龄林，幼龄林和成熟林组成较为相似，优势物种为子囊菌门和担子菌门。不同林龄林地样品与土壤理化性质和土壤酶活性的RDA/CCA分析表明，土壤理化性质中土壤全氮和容重对土壤样品OTU的影响较大，土壤酶中酸性磷酸酶和过氧化物酶对林地样品OTU的影响相对较大。PCA和PCoA分析表明裸地对照可分为一类，与中龄林相比，幼龄林和成熟林在组成上较为接近。随着林龄增长，林地微生物群落存在明显差异，表现出先降后增的趋势。
　　总而言之，不同林龄木麻黄林地土壤差异性和差异性细菌次生代谢产物较为丰富，且部分产物为已经鉴定出来的具有化感潜力的物质。差异性菌体发酵液可以对青皮、红厚壳和杨叶肖槿的种子萌发率产生抑制作用，也是其具有化感潜力的一个表现。菌液和中龄林土壤共有物质硬脂酸甲酯其合成过程中的关键酶类相对表达量存在差异。从真菌群落结构多样性对土壤微环境进行探索可知林地土壤真菌随林龄增长群落结构多样性呈现出先降后增的动态变化。

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第一章绪论

1.1 研究背景

1.2 研究概况

1.3 研究目的、意义

1.4 技术路线

1.5 研究地概况与样品采集

第二章 木麻黄林地土壤差异性细菌和真菌次生代谢产物的GC-MS鉴定结果

2.1 引言

2.2实验方法

2.3 结果与分析

2.4讨论与结论

第三章 木麻黄林地土壤差异性细菌和真菌发酵液对三种乡土树种的生物测定

3.1 引言

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论与结论

第四章 无花果沙雷氏菌硬脂酸甲酯合成过程中相关基因的RT-PCR分析

4.1 引言

4.2 材料方法

4.3 数据处理

4.4 结果与分析

4.5 讨论与结论

第五章 基于 PE250 平台分析不同林龄木麻黄林地土壤真菌群落结构

5.1引言

5.2材料与方法

5.3数据处理

5.4 结果与分析

5.5讨论与结论

结论

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢

答辩决议书