不同林龄木麻黄根内生菌群落结构多样性与化感潜力研究

摘要

近年来，关于木麻黄防护林的研究多集中于遗传育种、凋落物降解、种苗造林以及化感作用等方面，而针对木麻黄根内生真菌分离鉴定与群落结构多样性分析的研究仍鲜有报道。因此基于海南省木麻黄防护林的实际需求，本文选择海口市桂林洋海滨木麻黄的幼龄林、中龄林以及成熟林作为实验样地，运用了高通量测序平台，通过不同林龄木麻黄根内生真菌的丰度、群落组成及进化关系的分析，各林龄木麻黄根内生真菌群落的差异比较及动态变化，揭示了木麻黄根内生真菌的群落结构多样性；利用传统经典方法对不同林龄木麻黄根内生真菌分离，并与Biolog微生物自动分析系统相结合进行菌种鉴定；通过GC-MS技术对分离出的不同林龄木麻黄根内生真菌的发酵液进行萃取和鉴定，并与实验组前期各林龄木麻黄土壤、根、凋落物浸提液鉴定出的物质成分进行比较；同时利用不同菌体发酵液对乡土树种肖槿和红厚壳进行处理，从而探究不同菌体发酵液对两种乡土树种化感潜力的差异及影响。研究结果为揭示木麻黄根内生真菌在化感效应中的作用奠定了基础，并为进一步探讨木麻黄化感作用机制及途径提供理论基础，同时也为海南省防护林的更新、建设提供了科学的理论指导。本文研究结果如下：
　　1.基于Illumina Miseq高通量测序平台，共获得不同林龄木麻黄根内生真菌有效序列318972条，各林龄序列条数结果大小顺序为：中龄林，幼龄林，成熟林。不同林龄聚类树和柱状图组合分析表明幼龄林和中龄林聚为一类，表明在群落组成上木麻黄的幼龄林和中龄林更为相近，与成熟林存在差异。各林龄木麻黄根内生真菌优势菌门为子囊菌门和担子菌门。通过OTU丰度的PCA和PCoA分析表明：随着木麻黄林龄的增长，不同林龄木麻黄根内生真菌的结构组成上出现了差异，其中林龄大小是导致各样本离散的主要因素。
　　2.利用传统经典法对不同林龄木麻黄根内生真菌进行分离，并用无菌水检验法、组织印迹法验证无杂菌生长，基于Biolog微生物自动分析系统鉴定出木麻黄根内生真菌4株（青霉属2株，曲霉属2株）分别为棘孢曲霉、梅林青霉、新萨托菌属和离生青霉，均属于发菌科，为木麻黄根内生真菌的优势菌科。
　　3.GC-MS鉴定结果表明：不同林龄木麻黄根内生真菌的次生代谢产物鉴定出的物质主要为酯类、酚类、有机酸、酮类、醛类、醚类、醇类、吡啶类等多种有机化合物，表明各林龄木麻黄根内生真菌发酵液鉴定出的物质种类丰富且存在差异。并与不同林龄木麻黄土壤、根、凋落物浸提液鉴定出的物质比较，存在共同产物为2,4-二叔丁基苯酚、1,2,3,4-丁四醇、蓝桉醇；差异性产物分别为邻苯三酚、月桂酸、棕榈酸等。此外，利用甲醇萃取物质比采用正己烷作为萃取剂鉴定出的物质种类更丰富。
　　4.不同林龄木麻黄根内生真菌发酵液对肖槿、红厚壳乡土树种种子的萌发过程均有不同程度的抑制，降低了两种乡土树种种子的发芽率，并且肖槿、红厚壳乡土树种种子的绝对发芽率、绝对发芽势以及化感效应指数等也均受到了抑制。在同种菌体发酵液处理下，均表现为乡土树种红厚壳种子较肖槿种子对化感作用的耐受性更强。在不同菌体发酵液中，棘孢曲霉对肖槿和红厚壳种子萌发过程和发芽指标的影响最为明显。表明菌体发酵液中的化感物质种类及其含量是引起抑制作用的原因之一。
　　总而言之，不同林龄木麻黄根内生真菌表现出丰富的菌群多样性。随着林龄的变化菌群结构出现了差异，与林龄大小、林地环境因子以及林地化感物质积累等因素有关。此外，不同林龄木麻黄根内生真菌次生代谢产物中存在部分具有化感潜力的物质，并且菌体发酵液对肖槿和红厚壳两种乡土树种种子产生不同程度的抑制作用，也表现出具有化感潜力，表明微生物次生代谢产物是化感物质来源的一个重要方面。

目录

声明

第一章 绪 论

1.1 研究背景

1.2 研究现状

1.3 研究目的和意义

1.4 研究思路与技术路线

1.5 研究地概况与样品采集

第二章 基于Illumina Miseq高通量测序分析不同林龄木麻黄根内生真菌的多样性

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 数据处理

2.4结果与分析

2.5讨论与结论

第三章 基于传统经典法分析不同林龄木麻黄根内生真菌

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论与结论

第四章 不同林龄木麻黄根内生真菌次生代谢产物的GC-MS鉴定

4.1 引言

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论与结论

第五章 木麻黄根内生真菌发酵液对乡土树种的化感潜力测定

5.1 引言

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论与结论

结论

参考文献

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致谢

答辩决议书